菌种保藏和使用技术 浙江省食品药品检验所 王知坚.

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1 菌种保藏和使用技术 浙江省食品药品检验所 王知坚

2 菌种保藏和使用的有关概念 菌种保藏和使用的有关法规 我所现有菌种保藏管理规程 基层单位可以使用的菌种保藏使用技术 有关菌种问题的答复

3 概念 标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。 标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。
商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。 代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。 工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。

4 中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株

5 美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株

6 法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株（Bioball)

7 我所现在保藏的标准储备菌株

8 我所以往保藏的标准储备菌株

9 我所制备的工作菌株

10 法规 中国药典2005年版 中国药典2010年版 实验室认可准则 其他行业标准

11 中国药典2005年版 无菌检查法：灵敏度检查项下 菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 微生物限度检查法：细菌、霉菌及酵母菌计数项下 菌种 同无菌检查法

12 中国药典2010年版 在方法的附录中对菌种的规定同2005年版 在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定
允许使用标准菌株和商业派生菌株 标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活 标准储备菌株应进行纯度和特性确认 标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用 工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株

13 实验室认可准则 检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明（CNAS-CL09）
实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种或参照标本 标准菌种或标本必须从认可的菌种或标本收集途径获得。实验室必须建立和保存其所有菌种、标本的收集、贮藏、保存、确认试验的记录 实验室应有文件化的程序管理参照菌种（从原始菌种到日常工作用菌）。该程序应包括： 参照菌种必须定期转种传代，并做确认试验，包括实验室中所需要的关键诊断指标，实验室必须加以记录并予以保存

14 每一支参照菌种都应以适当的标签、标记或其它标识方式来表示其名称、标准号、接种日期和所传代数
其管理记录中还应包括（但不限于）以下内容： 从原始菌种传代到工作用菌种的代数； 菌种生长的培养基及孵育条件； 菌种生存条件。

15 其他行业标准 实验室质量控制规范食品微生物检测（GB/T 27405-2008） 实验室应制订并实施特定程序管理和使用标准培养物
实验室应通过标准培养物来验收培养基、验证方法和评估实验操作 实验室可使用来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有特性等效的商业派生菌株 标准菌株传代培养一次，制得标准储备菌株，同时应进行确认试验。建议使用深度冰冻或冻干的方法制备标准储备菌株。 标准储备菌株经继代培养获得工作菌株。一旦标准储备菌株被解冻，最好不要重新冷冻和再次使用。 工作菌株不可替代标准菌株。标准菌株的商业派生菌株仅可用作工作菌株。 标准菌株发生变化经验证不符合规定应及时销毁。

16 我所的菌种管理规程 菌种的采购 菌种的复苏 菌种的传代 菌种的保藏 菌种的使用和销毁

17 菌种的采购 每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。 所购菌种均为冷冻干燥菌种。 采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置4～6℃暂存。

18 菌种的复苏 菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。 菌种复苏应在生物安全柜内操作。
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。 取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。

19 菌种的传代 应在生物安全柜中进行菌种的传代 。 取经过纯度鉴定的第1代菌种管（琼脂培养基斜面培养物）用于传代制备第2代菌种。
接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培养5～6天，黑曲霉宜培养5～7天，其他菌种一般培养18～24小时。

20 菌种的保藏 保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70℃。 在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌号、传代日期和有效期。
所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。 该方法保藏菌种的有效期规定为6个月 。

21 菌种的使用和销毁 本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷冻菌种。
本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领取，并在《菌种领用记录》上记录菌名、数量、领用人等信息。 外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌名、菌号、数量，必要时可预约购买。 本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一套冷冻干燥菌种传代制备第1代原种保存）。 过期菌种应及时销毁，销毁时应经121℃ 20分钟的生物灭活处理。

22 我所对外提供菌种时所附的菌种使用说明和发放证明
菌种证明（2009年版）.doc

23 基层单位可使用的技术 通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法 通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方法

24 通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法 从我所采购超低温冷冻的标准储备菌株（第二代） 将所购菌株置4～6℃暂存，并尽快制备工作菌种
准备足够数量的琼脂斜面培养基 在生物安全柜内取标准储备菌株1接种环，划线接种至斜面上，重复操作直至所有斜面均被接种 将所有斜面培养基置适宜的温度培养适宜的时间 观察培养的情况，取其中1支进行镜检和必要的确认实验 确认符合要求的工作菌种进行必要的标识，置4～6℃保藏（第三代） 在规定的保存期内，取上述斜面培养物用于各种实验 至失效期前，取其中1支重复接种斜面培养基，制备第四代工作菌种

25 通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法 优点 操作简便 成本低 比较容易掌握 缺点 保存期比较短 反复传代有引起变异的可能

26 通过制备工作菌种进行菌种保藏的模式图

27 通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方法 准备低温冰箱，温度应能达到-30℃，最好能够装备超低温冰箱，温度达到-70℃ 准备适宜的液体培养基
将采购来的标准储备菌株在生物安全柜内吸取适量接种至液体培养基中 将培养基置适宜温度培养适宜时间 取适量培养物进行镜检和必要的确认实验 确认符合要求后，在生物安全柜内，向上述液体培养物中加入15～20％（V/V）的无菌甘油，混匀 取1～2ml上述混合物，置无菌冻存管或无菌离心管内 进行必要的标识 置低温冰箱中冷冻 取冻存管1支，解冻后，制备当月使用的工作菌种

28 通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方法 优点 缺点 保存期较长 反复传代导致菌种变异的风险较小 操作相对复杂 成本较高
操作流程相对较长，受到污染的风险较高

29 通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的模式图

30 有关菌种问题的答复 阳性菌的制备：领取工作菌种，从斜面上取一定量的培养物，稀释至系列梯度的菌悬液，分别测各梯度菌悬液的菌落数。临用时，取相应稀释菌悬液用于阳性试验，同时用平皿法测定加入的菌液中的菌落数。是否可行？ 对照用菌液的制备应取工作菌种，接种置适宜的液体培养基中，经培养后获得浓菌液，再进行稀释和确定菌浓度

31 菌种鉴定 简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定技术，如API鉴定条 基本程序为： 对疑似菌种进行纯培养 进行染色镜检
根据染色情况，并结合显色培养基等鉴定的初步信息，选择合适的鉴定条 根据操作说明书，得到各生化反应的鉴定结果，通过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果 也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统

32 请教黑曲霉及白色念珠菌具体传代及培养技术，操作中有何注意点？
采用的培养基应为改良马丁琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基 传代操作建议在生物安全柜内进行 白色念珠菌 斜面培养基的传代：取斜面培养的菌种管，用接种环取1白金耳，在待接种的培养基斜面上划线接种，培养即可 液体培养基的传代：取液体培养的菌种管，用毛细吸管取适量，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可 培养条件：20～25℃，24小时

33 黑曲霉 斜面培养基的传代：取斜面培养的菌种管，用灭菌水或灭菌生理盐水（也可以按照2010年版药典公示稿的方法）3～5ml洗脱孢子，吸取孢子悬液，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可 孢子悬液的传代：取孢子悬液，用毛细吸管取适量，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可 培养条件：20～25℃，4～5天 注意点 减少形成气溶胶的操作 佩戴手套和口罩进行操作

34 生孢梭菌计数：用营养琼脂培养基倒皿，厌氧罐培养长不出来，经确认菌是有活性的，厌氧指示颜色正确，-5，-6，-7均无菌落生长
对于生孢梭菌的计数，建议将所有稀释级均注皿培养 培养中的厌氧环境对生长与否是决定性的 有条件的实验室建议采用厌氧培养工作站 小型的厌氧培养可采用厌氧培养罐，但应严格按照使用说明操作，注意厌氧试剂、厌氧指示剂、催化剂的有效性

35 如何对菌种进行复壮，传代之前是否一定要做微生物学鉴定，确认是否有变异。
复壮的方法应根据待复壮的菌种的保藏形式来确定。对冻干菌种，复壮操作较为繁琐 微生物传代中的菌种确认是必须的

36 阳性对照是否必须购买菌种？菌种应该怎样保存？有效期一般为多长时间？
对照用菌种应采用标准菌种，一般应外购 保存方法如前述 有效期根据不同菌种，不同的保藏方法而异，如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的细菌有效期一般为1个月，能形成芽孢的细菌有效期一般为3个月，真菌的有效期为3个月。

37 铜绿假单胞菌在半固体培养基中生长不是很好，应如何保藏较好？ 菌种铜绿假单胞菌保存时放冰箱好还是室温好，贮存过程中菌种变色是否不能使用？
因铜绿假单胞菌有运动性，因此在半固体培养基中穿刺培养后无法形成穿刺线。接种时，将半固体取出直接在培养基上涂布即可。 也可以采用超低温冷冻的方式保藏，效果好 斜面保藏的菌种在冰箱中放置应注意控制温度，一般不宜低于4℃，也可以放置在室温中，但应控制温度不超过25 ℃。菌种保存过程中，的确会存在色素退化 的情况，此时对菌种进行传代培养，即可重新表现出色素，仍可使用。

38 今年购买的菌液接种后，生长出来较稀薄，是否因为混匀的关系，但放置菌液的瓶子混匀感觉也不是安全，请问是否有更好的方法，或者是否能仍提供固体培养基的菌种
建议采用琼脂斜面培养基复壮上述超低温冷冻标准储备菌株。从这些斜面培养基上取培养物接种，制备工作用浓菌液，其浓度可以得到保证

39 短小芽孢杆菌如何鉴定 通过显微鉴别，为不呈链状排列的杆菌，革兰氏染色为阳性。 营养琼脂斜面上菌苔光滑，薄，闪光，蔓延，不粘着，常常是浅黄色。
生化试验可选做明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐还原 ，结果为明胶缓慢液化，淀粉水解阴性，硝酸盐还原阴性。 采用API鉴定条，结合染色镜检和接触酶实验等结果

40 菌种传代至第5代时，还能不能用该斜面菌种接种制备工作用菌液
严格讲，这种操作是不符合药典规定的。药典所指的传代次数不超过5代，应该是指用于实验的工作用菌液。因此，从保藏的角度看，制备成的斜面保藏菌种只能到第4代。

41 菌种的常识，如菌种的保存、适宜的生长环境及存活时间、常见菌种的形态
细菌： 斜面保藏法：一般使用营养琼脂培养基，生孢梭菌使用液体硫乙醇酸盐培养基，在30～35℃培养18～24小时。存活时间1～3个月。 低温冷冻保藏法：一般使用营养肉汤培养基，生孢梭菌使用液体硫乙醇酸盐培养基，在30～35℃培养18～24小时。存活时间至少半年。 真菌： 斜面保藏法：使用改良马丁琼脂培养基，也可使用沙氏葡萄糖琼脂培养基，在20～25 ℃培养24小时至5天 低温冷冻保藏法：使用改良马丁培养基或沙氏葡萄糖培养基，在20～25 ℃培养24小时。黑曲霉不适用液体培养基培养。

42 谢 谢