葛花异黄酮化合物鸢尾苷和 鸢尾苷元的提取分离

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1 葛花异黄酮化合物鸢尾苷和 鸢尾苷元的提取分离
东北师范大学生物基础实验教学中心 葛花异黄酮化合物鸢尾苷和 鸢尾苷元的提取分离 孟祥颖 李玉新

2 以葛花为实验材料，经乙醇连续回流提取得总提取物，AB-8型大孔树脂柱纯化总异黄酮，聚酰胺柱细分离，得鸢尾苷和鸢尾苷元单体，薄层层析鉴定,使学生掌握天然有机化合物的提取、纯化、分离和鉴定的实验操作技术。

3 内 容 概 要 一、实验题目 六、实验的操作过程 二、实验的背景与原理 七、注意事项与建议 三、仪器、试剂及药品 八、思考题 四、实验方法
九、参考文献 五、实验结果及讨论

4 葛花中异黄酮化合物鸢尾苷和鸢尾苷元的提取分离
一、 实验题目 葛花中异黄酮化合物鸢尾苷和鸢尾苷元的提取分离 返回

5 二、 实验的背景与原理 常用中药葛根即为葛之块根，我国药食两用葛根主要为野葛[Pueraria lobata (Willd.) Ohwi]和粉葛（P.Thomsonii Benth）。在葛根的诸多成分中，异黄酮类是主要的功能成分，葛根素是其主要的活性成分，葛根及其有效成分的功能作用主要表现在对心、脑血管的作用：改善脑血液循环，对冠状动脉、心脏功能、心肌代谢的影响等。葛根素有扩张冠状动脉和脑血管作用，因其具有降血糖、血脂，抗氧化，改善血液流变学特性而广泛用于临床高血压、冠心病、急性脑梗死、糖尿病等病症的治疗。

6 二、 实验的背景与原理 为了扩大药物的资源，我们对葛根的地上部分之一葛花进行了系统研究，已往关于葛花的研究大多与乙醇相关疾病的研究有关，而关于心肌缺血方面的研究尚未见报道。我们从葛花中提取纯化了总黄酮，分离得到鸢尾苷和鸢尾苷元两个单体化合物，鸢尾苷是首次从野葛[Pueraria lobata (Willd.) Ohwi] 的花中提取分离出来的；且两种单体的分离纯化工艺具有高效、简单、价廉、环保和适合工业化生产的突出优点。

7 二、 实验的背景与原理 通过质谱、1H-核磁共振、13C-核磁共振、紫外光谱的鉴定确定了二单体的结构，通过高效液相色谱（HPLC）方法对葛花乙醇总提取物和其总黄酮中的鸢尾苷和鸢尾苷元进行了含量测定，得出葛花乙醇总提取物中鸢尾苷和鸢尾苷元的含量分别为2.85％和0.53％，葛花总黄酮中鸢尾苷和鸢尾苷元的含量分别为27.16％ 和3.71％，说明二者的含量可观，为药效学的研究奠定了基础。

8 二、 实验的背景与原理 在此基础上，通过观察葛花总黄酮和鸢尾苷元对小鼠心肌梗塞的保护作用，发现葛花总黄酮和鸢尾苷元都能够明显降低血清中AST、LDH和MDA的含量，说明二者对小鼠心肌梗塞都有一定的保护作用。对其作用机制的研究发现鸢尾苷元具有升高血清中SOD的活性，推测鸢尾苷元通过清除体内的氧自由基而达到保护心肌细胞的作用。此结果为将葛花总黄酮和鸢尾苷元开发为治疗心血管疾病的新药奠定了一定的基础，且为心血管疾病的治疗找到了新的药源。

9 二、 实验的背景与原理 HPLC: 标准品各0.08mg/ml， 以鸢尾苷:鸢尾苷元（2:1）比例进样 葛花总黄酮的HPLC谱图

10 二 、实验的背景与原理 大孔吸附树脂吸附的原理：大孔吸附树脂通过物理吸附和分子筛作用而实现分离。物理吸附遵从类似物质相吸附的原则，根据吸附物质的极性大小选择不同类型的树脂。极性较大的化合物一般在中极性的树脂上吸附；极性较小的化合物一般在非极性的树脂上吸附。

11 二、 实验的背景与原理 聚酰胺吸附的原理：聚酰胺是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键结合，并将其吸附，根据吸附力的大小不同，使能形成氢键与不能形成氢键的化合物达到分离。 固定相 流动相 返回

12 三、 仪器、试剂及药品 仪器：索氏回流提取器、水浴锅、层析柱、 旋转蒸发仪、层析缸。 试剂：乙醇、 5%FeCl3溶液。
药品：葛花、AB-8型大孔吸附树脂、聚酰胺。 返回

13 四、 实验方法 （1）鸢尾苷和鸢尾苷元的提取分离
葛花1Kg，粉碎后，装入索氏提取器，85%乙醇回流提取20小时，浸膏水浴加热挥发至无醇味而得总浸膏。加去离子水悬浮后，上AB-8型大孔吸附树脂柱。分别用20%、50%、95%乙醇依次洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得到混合物X。将混合物X上聚酰胺柱，依次用20%、30%、40%、50%、95%乙醇洗脱,收集30%、40%和50%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，而得到化合物Ⅰ和Ⅱ。

14 四、 实验方法 （2）鸢尾苷和鸢尾苷元的鉴定 A. 大孔吸附树脂洗脱液的薄层层析鉴定
取少量葛花85%乙醇回流提取液、20%、50% 和95% 乙醇的大孔树脂洗脱液，分别点样于非荧光的高效薄层板(HPTLC)，以CHCl3—MeOH—H2O(20:4:1)为展开剂，5%FeCl3溶液为显色剂。

15 四、 实验方法 B.聚酰胺柱洗脱液的薄层层析鉴定
取大孔吸附树脂的50%乙醇洗脱液、聚酰胺柱的20%、30%、40%、50%、95%乙醇洗脱液点样于非荧光的高效薄层板(HPTLC)，以CHCl3—MeOH—H2O(20:4:1)为展开剂，5%FeCl3溶液为显色剂。

16 四、 实验方法 C.聚酰胺30%和50%乙醇洗脱液析出物的鉴定
取聚酰胺30%和50%乙醇洗脱液析出物少许，70%乙醇溶解，与鸢尾苷和鸢尾苷元标准品的70%乙醇液共同点于非荧光的高效薄层板(HPTLC)，以CHCl3—MeOH—H2O(20:4:1)为展开剂， 5%FeCl3溶液为显色剂。 返回

17 五、 实验结果及讨论 1.葛花乙醇粗提物上大孔树脂柱，乙醇梯度洗脱，收集50%乙醇洗脱液，得到混合物X。将混合物X上聚酰胺柱，乙醇梯度洗脱, 浓缩30%、40％乙醇洗脱液的合并液及50%乙醇洗脱液，分别得到化合物Ⅰ和Ⅱ。 2.通过对大孔吸附树脂洗脱液的薄层层析鉴定，得出85%乙醇回流提取液中的黄酮化合物均存在于50%乙醇洗脱液中，而20% 和95%乙醇洗脱液中几乎没有，说明经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮集中富集于50%乙醇洗脱液中。

18 五、 实验结果及讨论 3.通过聚酰胺柱洗脱液的薄层层析鉴定，得出最初上样的50%大孔吸附树脂洗脱液，经乙醇梯度洗脱后，30%和40%乙醇洗脱液含有一个相同的成分，50%乙醇洗脱液含有另一个成分，且经洗脱液浓缩至小体积后，从30%和40%乙醇洗脱液中析出白色粉末状单体Ⅰ，从50%乙醇洗脱液中析出白色粉末状单体Ⅱ。 4.通过对聚酰胺30%和50%乙醇洗脱液析出物的鉴定，即与标准品共层析，得出单体Ⅰ为鸢尾苷，单体Ⅱ为鸢尾苷元。 返回

19 六、 实验的操作过程 步骤1 提取 步骤2 纯化 单体Ⅰ 步骤3 分离 单体Ⅱ

20 1.总黄酮的提取 1-1 药材粉碎包包 1-2 于索氏提取器中回流提取 1-3 回收溶剂 1-4 得干物质

21 1-1 药材粉碎包包

22 1-2 于索氏提取器中回流提取 此图片有超级连接，请点击

23 1-3 回收溶剂

24 1-4 得干物质

25 2.样品的纯化 2-1 吸附剂的装柱 2-2 样品上样 2-3 样品的大孔树脂柱洗脱 2-4 洗脱液的薄层鉴定 2-5 洗脱液的浓缩

26 2-1 吸附剂的装柱 先在底部放棉花 加入吸附剂 此图片有超级连接，请点击

27 2-2 样品上样

28 2-3 样品的大孔树脂柱洗脱 洗脱装置 此图片有超级连接，请点击

29 2-3 样品的大孔树脂柱洗脱 20%乙醇洗脱 50%乙醇洗脱 95%乙醇洗脱

30 2-4 洗脱液的薄层层析鉴定 大孔吸附树脂洗脱液 的薄层层析鉴定 结论：
因为50%乙醇洗脱液中成分与提取液相同，而20%和95%乙醇洗脱液中无成分，说明成分均在50%洗脱液中，所以下一步重点处理该洗脱部分，即浓缩处理和分离处理 20% 50% 95% 提取液

31 2-5 浓缩 浓缩的装置---旋转蒸发仪 浓缩后得到的粉末

32 3.单体的分离 3-1 聚酰胺装柱（同大孔树脂柱） 3-2 样品上样 3-3 洗脱,得到洗脱液 3-4 洗脱液的鉴定
3-5 浓缩洗脱液,析出两种单体 3-6 单体的鉴定

33 3-1 聚酰胺装柱（同大孔树脂柱） 装柱

34 3-2 样品上样

35 3-3 洗脱 洗 脱 柱 20％ 30％ 40％ 50％ 95％ 得5瓶洗脱液

36 3-4 洗脱液的鉴定 经薄层层析鉴定得出 ： 30%和40%乙醇洗脱液含有一个相同的成分，可合并； 50%乙醇洗脱液含有另一个成分。
聚酰胺柱洗脱液的薄层层析鉴定 经薄层层析鉴定得出 ： 30%和40%乙醇洗脱液含有一个相同的成分，可合并； 50%乙醇洗脱液含有另一个成分。 纯化液 20% 30% 40% 50% 95%

37 3-5 浓缩洗脱液，单体析出 30％和40％乙醇洗脱液 50％洗脱液 析出 析出 单体Ⅰ 单体Ⅱ

38 3-6 单体的鉴定 经薄层层析鉴定得： 单体Ⅰ为鸢尾苷 ； 单体Ⅱ为鸢尾苷元。 聚酰胺30% 和50%乙醇洗脱液析出物的鉴定 鸢尾苷标品
鸢尾苷元标品 单体Ⅱ 返回

39 七、 注意事项与建议 （1）大孔吸附树脂在使用过程中和贮藏过程中一定要注意不能使其变干了，要防止颗粒因干了变碎而不能使用。
（2）用高效液相色谱仪测定化合物含量时，样品一定要经过前处理，即一定要过膜除去不溶性物质，防止堵塞层析柱子。 返回

40 八、思考题 （1）大孔吸附树脂前处理和再生的方法是什么？ （2）聚酰胺的前处理和再生的方法是什么？
（3）大孔吸附树脂的常用洗脱剂及洗脱顺序是怎样的？ （4）聚酰胺的常用洗脱剂和洗脱顺序是怎样的？ 返回

41 九、 参考文献 （1）王金凤. 博士后出站报告，东北师范大学.2006.
（2）江庆华.葛根素的药理作用与临床应用近况. 中国热带医学.2006,(6)2:， （3）鄢良春. 葛根素治疗临床心血管疾病的研究进展. 四川医学.2006,(27):4 ， （4）Kyoung Ah Kang, Kyoung Hwa Lee, Sungwook Chae, et al. Cytoprotective effect of tectorigenin, a metabolite formed by transformation of tectoridin by intestinal microflora,on oxidative stress induced by hydrogen peroxide. European Journal of Pharmacology 2005，519:16-23. （5）尹俊亭,仲英,敬勇, 等. 葛花的研究进展. 中草药.2005，36(12):  

42 九 参考文献 再见！ （1）王金凤，2006，博士后出站报告，东北师范大学。
（2）江庆华，葛根素的药理作用与临床应用近况.　中国热带医学.2006,（6）： ， （3）鄢良春. 葛根素治疗临床心血管疾病的研究 进展. 四川医学. 2006, （27）：4 ， 　 （4）Kyoung Ah Kang, Kyoung Hwa Lee, Sungwook Chae , et al. Cytoprotective effect of tectorigenin, a metabolite formed by transformation of tectoridin by intestinal microflora,on oxidative stress induced by hydrogen peroxide. European Journal of Pharmacology 2005，519：16 – 23. （5）尹俊亭,仲英,敬勇,刘鲁,等. 葛花的研究进展. 中草药.2005，36（12）： 再见！