第九章 细 胞 培 养.

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1 第九章 细 胞 培 养

2 学习目标 1.会应用分离单细胞和单细胞培养的基本方法 2.会对分离的细胞进行培养

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4 Haberlandt： 高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞 首次进行离体细胞培养 小野芝麻、凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞

5 植物细胞培养(Plant cell culture）
指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。

6 单细胞培养 分离的单细胞 看护培养 微室培养 平板培养 单细胞无性系

7 机械法 用纤维素酶和果胶酸酶从组织分离 愈伤组织 叶片 愈伤组织或悬浮培养物(常); 一、细胞分离 制备单细胞: 获得单细胞的途径
由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞 叶片是分离单细胞的最好材料 愈伤组织或悬浮培养物(常); 用纤维素酶和果胶酸酶从组织分离 机械法 叶片 愈伤组织

8 （一）单细胞的分离 机械法 利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术。
⑴撕去叶表皮，暴露叶肉细胞，然后用解剖刀把细胞刮下来,离体细胞可直接种在液体培养基中培养。 ⑵先将叶片组织轻轻研碎，再通过过滤和离心将细胞纯化. 研钵中放入10g叶片和40ml介质（20µmol蔗糖，10µmolMgCl2、，20µmol Tris-HCl缓冲液，pH7.8）轻轻研磨，然后将匀浆用两层细纱布过滤，滤液经低速离心，使游离细胞沉降到试管的底部，得到纯化的细胞。 说明： 只有薄壁组织排列松散、细胞间接触面很小时， 用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。 液体培养

9 用纤维素酶和果胶酸酶从组织分离 酶解法 利用纤维素酶果胶酶使细胞间的中胶层发生降解， 分离出具有代谢活性的细胞的技术。
Takebe等(1968) 以烟草叶片为材料： 撕去下表皮后，将撕去下表皮的叶片切成4cm2的小块。放入经过过滤灭菌的酶溶 液中（含0.5%果胶酶，0.8%甘露醇和1%硫酸葡聚糖钾），真空抽气后，在摇床上 保温培养，每30min更换一次酶液。将第一个30min 后换出的酶液弃掉，第二个 30min 后的酶液中主要分离海绵细胞，第三和第四个以后主要分离栅栏细胞。 酶解法的特点： 能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。 但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护, 防止细胞的胀裂。 液体培养

10 注意： 大麦、小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离。因为叶肉细胞较长，并在许多地方收缩，细胞间有链状互锁结构阻止细胞的分离。
机械法和酶解法比较 机械法： 1、细胞不会受到酶的伤害； 2、质壁不会分离； 3、细胞产量低； 4、细胞易破坏。 酶解法： 1、细胞会受到酶的伤害； 2、质壁可能分离； 3、细胞产量高； 4、细胞不易破坏。 小麦

11 愈伤组织或悬浮培养物(常); 茎段 悬浮振荡培养 1） 诱导产生愈伤组织； 2） 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；
3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物. 把未分化和易散碎的愈伤组织转移到装有液体培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上进行振荡培养，并得到游离细胞。 茎段 悬浮振荡培养

12 优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。
振荡的作用： ⑴对细胞团施加一定的压力，使之破碎成小细胞团或单细胞。 ⑵促进培养基和容器内空气之间气体交换，保证细胞正常代谢。 优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。

13 二、单细胞培养方法 （Single cell culture） 1.平板培养法 2. 看护培养法 3. 微室培养方法 4.条件培养基培养法

14 平板培养法

15 （一）、看护培养法（Nurse culture）
1 看护培养的含义及用途 含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。 就是把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织 和培养的细胞之间有一层滤纸相隔。 用途：诱导形成单细胞系。

16 2 看护培养基本技术 （1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。
2 看护培养基本技术 （1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm²）已灭菌的滤纸，放置一晚上。 （3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。

17 Single cell Filter paper Nurse callus 看护培养图示： 2~3月
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织 恒温培养1个月 2~3月 Nurse callus Filter paper Single cell 单细胞无性系

18 优点： （1）简便易行。 （2）效果好，易于成功。 缺点： （1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。
3、看护培养特点： 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养则分裂的原因： 看护愈伤组织给单细胞提供了培养基的营养成分和促进细胞分裂 的其它活性物质。 优点： （1）简便易行。 （2）效果好，易于成功。 缺点： （1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。

19 （二）、微室培养法（Microculture）
1 微室培养的含义及用途 含义:将单细胞培养人工制造的一个小室中（少量的培养基中）进行培养。 用途:主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。

20 微室培养图示： 微室培养要求： 微室内不能有气泡。 微室的厚度最好不要超过20微米， 盖玻片的厚度要在0.17-0.18mm左右。
 微室内不能有气泡。  微室的厚度最好不要超过20微米， 盖玻片的厚度要在 mm左右。  观察时要保持温度和培养时一致。 微室培养图示： 凹穴载玻片 1滴含单细胞培养液 周围加石蜡油 旁边加石蜡油 置培养皿中26~28 ℃恒温培养 盖盖玻片 盖盖玻片 平视图

21 2 微室培养特点： 优点： （1）在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程 缺点： （1）培养时间较短

22 （三）、平板培养法（Plante Culture）
1 含义及用途： 含义:将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。

23 2 特点 用途:分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。
2 特点 优点： （1）可以定点观察； （2）分离单细胞系容易； 缺点： （1）培养细胞气体交换不畅。

24 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为1×10 ³ -100×10 ³ 个/ml 。
3 平板培养的基本技术 (1)、悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为1×10 ³ -100×10 ³ 个/ml 。 初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度

25 （2）培养基配制 A.直接配制1.4%琼脂基本培养基 B.1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。 （3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板。 (4)培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微镜观察，记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。

26 植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每 100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出小细胞团）。
小细胞团计数方法： 1）低倍显微镜直接计算； 2）细胞团显影法 显影仪

27 平板培养应注意的问题： （1）选用的培养基必须是能够在低的细胞起始密度下使细胞生长。 （2）不要选用处在静止期过久的细胞。
（3）在固体培养基中适宜的起始密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为5-10×103/ml（4）接种时固体培养基的温度要严格控制，一般不超过35 ℃，温度低对细胞伤害小，但操作困难，凝固快会造成细胞分布不均。

28 将悬浮培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团 在浅层液体培养基中培养。
条件培养基培养 在培养基中加入高密度的细胞进行液体培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，过滤掉其中的细胞，将这种这种培养基再制成液体或固体培养基来培养单细胞或细胞团，这样可明显提高单细胞培养物的存活和分裂的能力。 液体浅层培养 将悬浮培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团 在浅层液体培养基中培养。 用途：主要用来增殖细胞。 特点：有利于有毒物质的扩散；有利于气体交换；不利于定点观察；单细胞生长、分裂后，难以得到单  细胞系。 条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。

29 三、影响单细胞培养的因子 1、条件培养基 2、细胞密度(>临界密度) 3、生长激素 4、pH 5、CO2

30 第二节、细胞悬浮培养 Suspension culture 含义及特点 1、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养 2、特点
1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

31 一、悬浮培养类型和方法 成批培养 连续培养

32 注：悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。 起始悬浮液的制备 愈伤组织 液体培养基 摇床振荡  转速30-150rpm 2-3cm冲程防细胞破裂 悬浮培养 要求：质地疏松，细胞分散程度大。 （质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养）

33 （一）、成批培养/分批培养（Batch culture）
含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行 培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常 用的培养方法。

34 1、成批培养特点 （1）培养基体积固定； （2）必须适当搅拌； （3）培养过程中，细胞生长，其数目不断 发生变化，呈S增长； （4）但要进行下一批培养，则生长一定时 间后，需要继代转移。 2、成批培养的方法 (1)旋转培养 (2)往返震荡培养 (3)旋转震荡培养 (4)搅动培养

35 细胞生长曲线 5 4 3 2 1 ①延滞期：细胞很少分裂，细胞数目增加少。 ②对数生长期：细胞分裂活跃，数目迅速增加。
③直线生长期：细胞增殖最快时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定, 细胞数目达到最高峰。 ④缓慢期：培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，增长速度逐渐变慢。 ⑤静止期生长趋于完全停止。 细胞生长曲线 培养时间 培养细胞数目 1 2 3 4 5 延迟期 对数生长期 直线生长期 缓慢期 静止期 1 2 3 4 5

36 （二）、连续培养（Continuous culture）
含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。

37 1、连续培养的特点： （1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应； （2）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中； （3）适于大规模工业化生产 培养时间 培养细胞数目 1 2 3 4 5

38 2、连续培养的种类： (1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液 (2)连续培养：
不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基 半连续培养

39 半连续培养 利用培养罐进行大量细胞培养的一种培养方式。 当培养罐内细胞数目增殖达到一定数量后，将1/2的细胞悬浮液倒于另一个培养罐中，分别添加新鲜培养基继续培养。 该培养方法能重复地获得大量均匀一致的培养细胞。

40 连续培养图示： 加入培养基 利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。 特点：
⑴不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，可以保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。 ⑵可在培养期间内使细胞长时间保持在对数生长。 ⑶适于大规模工厂化生产。 排出培养基及其培养物

41 细胞的工厂化生产 工厂化生产途径的3个步骤： 1.高产细胞株的选择
将所分离纯化的细胞群，以一定密度接种进行平板培养,根据不同培养目的对其进行鉴定和测定，从中选择出高产、高品质的单细胞无性系。 2.“种子”培养 对高产的细胞株或细胞无性系进行扩大繁殖，目的是获得培养细胞来用做大量培养时的接种材料。 3.细胞的大规模培养 将选择的目的单细胞无性系，用发酵罐或生物反应器进行工厂化细胞培养以生产所需要的化合物。

42 FMS (II) 型台式发酵罐适用于如基因工程菌高密度高表达需要的高供氧、快速均匀升温等要求，能迅速实现生物技术实验室成果转化。
其主要技术特点： 采用独特的外循环水泵控温系统简洁有效的单片计算机自动控制和数据采集系统以及最新器件 直观的带光电显示工艺流程示意图 新颖美观的整体外型和赋有人性化的设计

43 二、细胞悬浮培养主要应用 1、 植物有用物质的生产 2、诱发和筛选突变体 3、原生质体培养和细胞分离 4、食品生产。

44 1、不受季节变化、土地制约、地域气候条件的影响； 2、可以人为控制培养条件、提高次生代谢产物的产量； 3、可排除病菌、虫害的影响；
天然化合物的生产与转化 （一） 植物次生代谢产物的生产 细胞培养生产次生代谢产物的特点: 1、不受季节变化、土地制约、地域气候条件的影响； 2、可以人为控制培养条件、提高次生代谢产物的产量； 3、可排除病菌、虫害的影响； 4、利于大规模工业化生产。 （二） 进行特定的生物转化反应 生物转化：通过一系列生理生化反应，将天然有机物产物 转化为新的化合物或提高该物质的产量的过程。 例如，高辛、茛菪碱等合成。

45 细胞突变体的诱变与筛选： 例如在培养基中加入不同浓度的NaCl，通过胁迫诱变和筛选抗盐突变体。还可以向培养基中加入病原体的毒蛋白，以诱变和筛选抗病突变体。 为了改善作物品质，可以进行抗赖氨酸类似物的诱变与筛选，即在培养基中加入不同浓度的赖氨酸类似物，可以获得抗赖氨酸类似物突变体。这种突变体中的赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的水平升高。 总之，借助植物的细胞培养，可以从多途径上用于作物的改良研究。

46 思考题 1.什么是细胞培养？细胞培养的方式有哪些？各有什么优缺点？ 2.细胞悬浮培养定义？成批培养的几个时期是什么？连续培养是选用的那个时期？ 3.细胞悬浮培养有哪些用途？

47 谢谢!