Western-blot 试验技术.

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1 Western-blot 试验技术

2 概论 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。

3 溶解蛋白策略 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反应性的丢失。
2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多种形式起反应。

4 溶解方法 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。
2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液裂解。

5 细胞准备 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠。吸入1.5ml离心管。
4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上清转入另一Eppendorf -80°C保存

6 注意事项 细胞裂解液的量 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。
检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 未知蛋白应同时作阳性对照。

7 主要试剂 RIPA（华舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司）
丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）

8 仪器与设备 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司）
电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）

9 配制试剂 10×电泳Buffer 称取Tris-base 30.3克 glycine 144克 加去离子水，定容至1000ml
SDS 克 1.5M Tris.HCl PH 8.8 称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml 0.5M Tris.HCl PH6.8 称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml 转膜缓冲液 称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，临用前加200ml甲醇 10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml。

10 配制试剂 30％Acry-Bis 29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4℃保存
10％过硫酸胺，新鲜配制，<1week 0.1克过硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4℃保存 封闭试剂 10×TBS （应用液：1×TBS） 10×TBS：取24.2克Tris－Base 80克氯化钠 用800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定容至1000ml 1×TBS：取10×TBS 50ml，稀释至500ml，临用前加0.1％Tween 20，500ul。

11 配制试剂 4×SDS Sample Buffer 2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中，调pH6.8 8克SDS
10ml DTT贮存液 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后-20℃保存，分装成1ml。 考马斯亮兰染液： 45ml 甲醇 45ml 水 用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质 10ml 冰乙酸 0.25克 考马斯亮兰R250

12 抗体选择 一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是彻底变性的。 多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物，通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。 设置对照： 1不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗体） 2 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合物为佳。

13 实验步骤 配胶 制胶 先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用，拔去梳子。 上样，所有上样孔均加样，没有样本，用上样缓冲液代替。 100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳结束。

14 实验步骤 转膜 小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中平衡过的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝胶同样大小，按次序叠放在一起，在4度100V电压转膜1H,取出硝酸纤维素膜，右上角切去以作标记，丽春红染色，可见多条粉红色条带，再用TBST漂洗至膜发白。 封闭 称取脱脂奶粉1克，用1×TBS溶解到20ml，使脱脂奶粉浓度为5％。将硝酸膜浸在20ml封闭液中，室温摇2h后。

15 实验步骤 一抗杂交孵育 将一抗用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。二抗孵育 二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度为1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀释液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。

16 实验步骤 显影：将膜置入10ml LumiGLO溶液中（10ml LumiGLO溶液配方为：0.5ml 20×LumiGLO、0.5ml 20×Peroxide、9.0ml Milli-Q water），室温轻摇1分钟，注意避光操作；在暗室中剪下与膜同样大小的胶片，压在暗盒中，约1min；将胶片放在显影液中洗1-5min；水冲洗；定影液中洗2-5min；水冲洗，可在相应位置见到目的条带。

17 疑难杂证 没有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。

18 疑难杂证 做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者多种一抗的吗？
最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。 曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这两种目的蛋白的分子量相差较远，转完膜后，一边给Marker染色，一边封闭。在上一抗之前，根据Marker的条带把膜水平剪开，分子量小的目的蛋白在下面半张，大的在上面半张。然后分别上一抗、二抗，检测。

19 疑难杂证 western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 都可以用丽春红染色。 具体使用还要参考相关文献

20 疑难杂证 做western，在分子量很低的位置总是出现一条很强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？是蛋白降解了吗？
有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异也是可能的，关键是你要的位置出现了吗？ 减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视具体情况了。

21 疑难杂证 请问分子量为41KD和57KD作WESTERN时,可以分开切胶吗?分别用多大电流转膜?转多长时间?
理论上分的开！蛋白Marker分子量分别为97kd 66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白时，分离的效果都比较好！分子量为41KD和57KD的蛋白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd，蛋白分子量相差15KD，分离效果很明显。应该可以分开切胶！

22 疑难杂证 分别用多大电流转膜? 一、一般跟你的分离胶的浓度有关。 二、与你的转印系统型号有关. 三、与目的蛋白的分子量有关. 一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；

23 疑难杂证 WESTERN为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗,请指教 .做WESTERN必须要内参吗？ 1、一抗、或二抗抗体浓度太高 2、多克隆抗体本身的非特异性反应 3、抗体的特异性不强 4、目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化.所以严格意义上说,内参是必须做的。

24 疑难杂证 western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？ 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。

25 疑难杂证 以下是关于合适抗体选择的优缺点比较，帖子上表格排不齐，只好以图片形式抓了下来。

26 疑难杂证 为什么细胞提取液中没有目标蛋白？ 答：原因有很多，1 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；2 细胞中的蛋白质被降解掉了，必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；3 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。 细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：1 有沉淀可能是因为蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，2 也不排除抗原浓度过高，这时再加入适量sample buffer即可。

27 疑难杂证 蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？ 答：可以选择PSQ膜,同时缩短转移时间.也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤可 目的带很弱，怎么加强？ 答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。 胶片背景很脏，有什么解决方法？ 答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，牛奶浓度提高。

28 疑难杂证 目标带是空白，周围有背景，是为什么？ 答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。 我的胶片是一片空白，是怎么回事？ 如果能能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。1 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；2 ECL底物中H2O2，不稳定，失活；3 ECL底物没覆盖到相应位置；4 二抗失活。 问我显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢? 1可能是红灯造成的,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善. 胶片本来就被曝光了2显影时间过长.

29 疑难杂证 DAB好还是ECL好？ DAB(二氨基联苯胺) 有毒,但是比较灵敏,是HRP最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。 抗原分子量是资料上的两倍，是怎么回事？ 抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。在上层胶中加入尿素至8M也可以打开。 半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？ 一般参照 膜>= 滤纸> 胶, 就行，你转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

30 疑难杂证 电泳时Marker 按说明加5ul，但电泳中看不见，是失活了吗？ 加入20ul即可。
一抗量较少，同时不知道一抗的最佳稀释比例是多少，怎么做呢？ 确定实验过程无污染后，将含抗体的稀释液回收，保存于-70℃。最好第一次的 浓度做高一点，这样，如果结果不好，可以尝试再稀释。

31 免疫沉淀法检测表达蛋白 可用于检测并定量分析多种蛋白质复合物中的靶抗原。 很敏感，可检测出100pg的放射性标记蛋白。
当与SDS-PAGE并用时，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况。

32 操作步骤 靶蛋白的放射性标记 裂解细胞 特异性免疫复合物的形成 免疫复合物的收集和纯化 放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析

33 靶蛋白的放射性标记 同位素通常是35S，其半衰期为87.1天，同位素是以35S－标记蛋氨酸或35S－蛋氨酸和半胱氨酸。
这些氨基酸是哺乳动物细胞的必须氨基酸，必须由培养基中提供。 培养基中含有高浓度的蛋氨酸和半胱氨酸，为了增加同位素标记氨基酸的渗入率，可去除培养基中的蛋氨酸或同时去除蛋氨酸和半胱氨酸。 同位素标记的强度取决于被检蛋白的合成速度和其氨基酸的组成，以及该蛋白质的代谢速度。

34 免疫复合物的收集和纯化 用耦联葡萄球菌蛋白A和Sepharose进行吸附：结果清晰，但成本高，并且所需抗体有种系特异性的限制。
用经热致死并经甲醛固定的S.aureus细胞进行吸附：背景高，但是经济。 用抗被检蛋白抗体的抗体进行吸附，这种方法用于下列两种情况：1第一抗体的FC不能被葡萄球菌蛋白质A识别；2对被检蛋白进行定量分析时。