第五章 诊 断 酶 学 泰山医学院 生化检验教研室 陈强.

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1 第五章 诊 断 酶 学 泰山医学院 生化检验教研室 陈强

2 教学要求 1.掌握血清酶的来源与去路及其变化的病理 机制 2.掌握临床常用血清酶、同工酶及其亚型 3.熟悉酶活性测定技术、酶的免疫化学测定 同工酶及其亚型测定 4.熟悉酶活性浓度定义及酶促反应进程。 5.了解酶的基本概念，底物浓度对酶促反应速度的影响。

3 第一节 酶的概念与特征（自学）

4 第二节 血 清 酶 “血清酶”是指存在于血清中的酶，而非血清特定产生的。

5 一、血清酶的来源 血 清 酶 根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，将其分为： 一般代谢酶 组织专一酶 血浆特异酶 非血浆特异酶
外分泌酶 细胞酶 血浆特异酶 非血浆特异酶 外分泌酶 细胞酶 血 清 酶 血浆特异酶 血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥催化作用； 以酶原形式分泌入血； 肝脏中合成； 血中含量以mg％表示； 一般代谢酶 组织专一酶

6 胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等
名称 血浆特异酶 非血浆特异酶 外分泌酶 细胞酶 一般代谢酶 组织专一酶 来源 肝 消化腺或其它外分泌腺 各组织器官 （无器官专一性） 肝 （有器官专一性） 种类 凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纤溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等 胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等 LDH、AST、ALT、CK、MDH等 OCT等

7 二、血清酶的去路 酶蛋白在血管内的失活与降解（主要代谢去路） 肝或网状内皮系统对血清酶的清除 血清酶的半寿期（T1/2)：
酶失活至原来活性一半所需时间。 有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异。 少数以酶原形式存在的血清酶类（凝血酶原、纤溶酶原）在活化后迅速被肝清除，网状内皮系统也可能参与血清酶（LD、AST、AMY、CK等）的清除。 血清酶的排泄 转入其它体液 尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途径，如胃蛋白酶原、淀粉酶（AMY）。 只有血清酶的来源与去路保持平衡，才能维持酶活性保持相对恒定。但一些病理情况往往促使这种平衡被打破，导致血清酶活性的变化。 血清酶甚至同工酶之间半寿期差别很大。这些有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异，半寿期长的酶，在血清中持续时间长。

8 三、血清酶变化的病理机制 （一）合成异常 肝损害导致合成酶的能力受损 （ChE、LCAT） 合成减少 酶基因变异引起酶合成减少 （铜氧化酶）
增生性疾病（骨骼疾病，ALP) 恶性肿瘤（前列腺癌，ACP) 酶的诱导作用（乙醇，γ-GT） 合成增多

9 （二）释放增加（大多数血清酶增高的主要机制）
细胞内外酶浓度的差异 对于非血浆特异酶，细胞内外浓度差可在千倍以上，只要有少量细胞坏死或病变，血中酶浓度明显升高。对血浆特异酶，细胞病变很少引起血中酶浓度明显升高。 酶的相对分子量（影响细胞内释出的关键） 酶从细胞内释出的速度与酶的相对分子量成反比。如AMI时，血中最先升高的是CK（MW：85kD)，LD （MW：125kD)出现升高明显延迟。 酶的组织分布 含酶量高且血流丰富的组织器官，其细胞内酶进入血流的可能性大；除少数组织专一性酶以外，大多数血清酶不能特异反映某个特定组织的病变。但同工酶的发现大大提高酶检测的组织的特异性。 酶在细胞内的定位及存在形式 线粒体酶不易从细胞中释出，如ASTm的检测往往反映肝细胞的损伤程度，且是AMI中最后升高的酶，用于判断预后；有些酶在细胞内与结构蛋白结合，较难释放。

10 （三）排出异常 肾功能减退，血清AMY活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留。
胆道梗阻，血清ALP升高的原因是梗阻区ALP合成加强，ALP排泄受阻而逆流入血。 大多数酶，不存在以上的清除机制。

11 四、血清酶的生理差异 （一）性 别 多数酶无差异，少数有差异 男性高于女性： CK、ALP、 γ-GT 女性高于男性：LDH1（青年妇女）
（二）年 龄 最明显的例子是ALP，新生儿血清中ALP略高于成人，1～5岁增至成人的2～3倍，然后逐渐下降，到10～15岁，ALP又明显升高，可达成人的3～5倍，20岁后降至成人值。 （三）饮 食 （四）运 动 血清中大多数酶不受进食影响，故测定酶活性不一定需要空腹采血。 激烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如CK、LD、AST、ALD、ALT等活性升高。 （五）妊 娠 （六）其 它

12 第 三 节 酶促反应动力学

13 酶促反应进程 反应级数 Lag phase Linear phase [P] Zero order First order
零级 一级 [P] Linear phase 线性期 Zero order 非线性期 First order 延滞期 V ＝ dp dt 时间 酶促反应时间进程曲线

14 单试剂测定体系酶促反应进程曲线

15 结论： 为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期（零级反应期）的反应速率才能准确计算出酶活性浓度否则将导致误差。 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度达到Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的V，此时V与[E]之间有线性关系。

16 第 四 节 酶活性浓度的测定技术

17 直接测量非常困难（mmol/L或mg/dl）
一、酶活性浓度的概念 1. 酶的特性：微量性、高效性等。 通过测定被加速化学反应的反应速率，来间接反映酶的浓度 直接测量非常困难（mmol/L或mg/dl） 2. 酶促反应 E S E S E P E + P E + ES V＝ ds dt 或 dp

18 3. 酶活性浓度 即酶所催化的化学反应的反应速率，用酶促反应中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来计算。 注意：只有当酶所催化的反应速度仅与 [E] 成正比，而不受其它因素影响时，即在酶促反应的零级期，才能根据酶所催化的化学反应速率来确切表示酶活性浓度的大小。

19 实际上是通过检测酶活性浓度间接反映酶的量，因为直接检测酶的质量浓度要求的实验条件及技术条件非常高，价格昂贵，不适用于临床检测，因此测定酶活性浓度是临床酶学分析最为常见的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。 但仅在上述前提下，只能在反应的零级期，即只有在酶促反应的最适条件下，才能真实地代表酶含量。因此可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的检测。

20 二、酶活性浓度测定方法 （一）按检测方法分类
根据底物或产物有特征性的物理化学特性（如颜色、浊度、吸光度、pH、气体、放射性等），设计检测装置用于临床酶活性浓度测定。 检测装置：比色计，浊度仪，分光光度计，荧光分光光度计，电位滴定仪，量积仪

21 （二）按反应时间分类 1、定时法（取样法、终点法、两点法） 优点：
简单，测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择不考虑对酶活性的影响。 缺点： 无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。 注意： 应先做预实验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间；保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要精确。

22 目前临床应用较少，通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法。
2、连续监测法（动力学法、速率法） 优点： 容易找到直线区域，选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。 缺点： 线性反应期因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定，必须选取酶促反应的最适反应条件，需要有可以连续监测的设备。 3、平衡法 目前临床应用较少，通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法。

23 三、连续监测法测定酶活性浓度 （一）种类 1.直接法
不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化性质的变化（如：A、荧光、旋光性，pH、电导率、粘度等），从而计算出酶活性浓度。 评价 方法简单，但只有底物与产物之间，在理化性质方面有显著性差异时，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法测定。

24 其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物。
（1） 目前以分光光度法最为广泛， 利用340nm处吸光度的变化测定各种脱氢酶。 仅在260nm处有吸收峰 在260、340nm处有吸收峰 NAD(P)++H NAD(P)H 340nm处A的变化可以反映反应体系中NAD(P)H量的增减，进而反映酶活性浓度。 （2） 利用一类人工合成的所谓色原性底物， 其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物。

25 2、间接法 （1）在原反应体系中加入一些试剂，其只和酶反应物迅速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和酶反应，也不影响酶的活性。
S P E + 试剂 可被检出的物质 （2）酶偶联法 目前应用最多，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。

26 （二）酶偶联反应 反应模式 A B P A B C P 被测酶 始发反应 指示反应 Ex Ei 指示酶 辅助酶 辅助反应 Ex Ea Ei
酶偶联体系 辅助反应

27 1. 酶偶联反应时相 酶偶联反应一开始不能反映酶活性，在反应中存在几个时相。以临床常规酶学分析中常见的ALT的检测为例，在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶，反应原理如下： ALT L-丙氨酸＋α-酮戊二酸 α-丙酮酸＋ L-谷氨酸 α-丙酮酸＋NADH 乳酸＋NAD+ LDH ALT双试剂法测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37°C保温5m，将样品中所含的内源性α-酮酸消耗完。然后再加入α-酮戊二酸启动ALT催化的反应。 此时反应的方向由NADH转变为NAD，随反应进行，A应随之而下降，通过检测反应产物A在340nm处A的变化速率，可以检测指示酶反应。

28 反应一开始加入的试剂1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此时相中，存在于样品中的干扰物质（内源性α-酮酸）消耗完。
随着产物α-丙酮酸增加到一定程度，Ex和Ei反应V相同，达到稳态期。此阶段340nm处A出现明显的线性变化。 加入试剂2（即α-酮戊二酸）启动反应，在初始阶段，产物α-丙酮酸开始出现，并逐渐增多，但处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表待测酶的Vx。 最后由于底物的消耗，反应V逐渐减慢，偏离线性。

29 2. 酶偶联反应注意事项 (1)延滞期应越短越好，测定时间要避开此期。
(2)不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定，酶偶联反应V应超过或等于Vx，Ei反应必须是一级反应，即指示酶反应速率和测定酶的产物B浓度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小时才能做到。 (3)从经济方面考虑应选用一些来源容易且价格便宜的酶（指示酶）制剂。 (4)适当的指示酶的用量，反复实验法确定，即做到酶偶联速率不随酶量的增加而升高，并在所选的最适条件下，指示酶偶联反应速率和酶活性浓度成正比。

30 解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正，另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。
（三）干扰因素 (1)其他酶和物质的干扰 (2)酶的污染 (3)非酶反应 (4)分析容器的污染 (5)沉淀形成 解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正，另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。

31 四、血清酶活性浓度测定条件的优化 方法 仪器设备 试剂 自动生物化学分析仪参数设置 标本的采集、运输与保存

32 标本的采集、运输与保存 溶血：细胞内酶而言，细胞内外浓度差异大；所以应及时进行分离，静脉采血后应在1～2h内分离血清。
抗凝剂：利用草酸盐、枸橼酸盐、EDTA抗凝的血浆一般不用作酶活性测定；肝素对ALT、AST、CK、LD、ACP检测均无影响，可用于急诊；临床多用血清为首选测定标本。 温度：大部分酶在低温中比较稳定，一般在血清分离当天测定，否则应放冰箱冷藏；通常在0～4 °C下使用、处理及保存，除了一些冷变性的酶；液氮可作为酶学测定时血清标本及质控长期保存的方法。

33 五、酶活性浓度单位 （一）酶活性单位 惯用单位 国际单位
用首先报告该种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名其单位，即使同一种酶因方法不同而有数种活性单位，参考值差别很大。 国际单位 1963年，1IU＝1μmol/min （25 °C 及其他最适条件下） 1976年， 1U＝1μmol/min（特定条件下） 1979年，1Katal＝1mol/s（规定条件下），1U＝16.67nKatal

34 （二）酶活性浓度单位 以每单位体积所含的酶活性单位数表示； 各国学者习惯用U/L表示体液中酶催化活性浓度，
1U/L=16.67nKatal/L

35 （三）酶活性浓度计算 连续监测法检测酶活性浓度时，使用摩尔消光系数（ε）。其定义为：特定条件下，一定波长的光，光径为1.0cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00mol/L时的吸光度。 连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化（ΔA/min） U/L＝ ΔA min × V×106 ε ×v× L ΔA—吸光度变化 —把mol换算成μmol v—样品量（ml） L —比色杯光径（cm） V—反应体系体积（ml） ε —摩尔消光系数（cm2 · mol-1 ）

36 参考范围 正常上限（upper limits of normal，ULN）倍数 把酶测定值转换为正常上限值的倍数；
易于比较解释来自不同方法的结果，利于各实验室间质评调查； 可将ULN进一步适当分级，制定出轻度、中度及重度增加的范围，使检测结果更加一目了然；

37 六、系数K值的计算与应用 K值为酶活性浓度定量系数(或称为常数)，主要用于临床酶活性测定的计算与校正。 Ｕ／Ｌ = ——— × ———
V总· △Ａ Ｕ／Ｌ = ——— × ——— ·L·V标 min △Ａ Ｕ／Ｌ = ——— × Ｋ min K值为酶活性浓度定量系数(或称为常数)，主要用于临床酶活性测定的计算与校正。

38 (一)系数K值的意义与设置 Ｋ过高：测定线性较宽，重复性差， Ｋ过底：检测线性窄，但精密度好。
K值的设置应考虑测定酶的参考值上限及测定时间两方面。这些都与仪器测定的噪音(noise)有关。 检测时间长，参考值上限高时Ｋ可设置大一些，反之Ｋ值设小一些。

39 (二)系数K值的类型与计算 在临床应用中要注意：应在具体仪器条件下，实际测定指示物的ε和系数K值。 　　340nm干涉滤光片的NAD(P)H的ε可用葡萄糖的己糖激酶法实测，即对已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)H，计算其实测的ε，再计算实测K值。光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。

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41 七、临床酶学测定的标准化

42 (一)标准化途径 1、使用推荐方法和参考方法 2、使用公认的酶校正物或酶参考物
　(一)标准化途径 　　1、使用推荐方法和参考方法 　 2、使用公认的酶校正物或酶参考物 目前国内外推荐有证参考物(certified reference material，CRM)、标准参考物(standard referencematerial，SRM)和酶参考物(ERM)用于酶学测定的校正。 这些物质可校正一个或多个常规方法。酶校正物的使用可改进方法间的符合程度，增加常规酶测定方法的可靠性。

43 (二) 全球参比体系 IFCC于1998年决定建立包括下列要素的测定酶催化浓度的全球参比体系： 1．参考测定方法 2．参考实验室网络
(二) 全球参比体系 IFCC于1998年决定建立包括下列要素的测定酶催化浓度的全球参比体系： 1．参考测定方法 2．参考实验室网络 3．参考物

44 第五节 酶的免疫化学测定

45 20世纪70年代以后，随着新技术特别是免疫学技术的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶蛋白质量的新方法。

46 测定原理 免疫化学法是利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体后用免疫学方法测定酶浓度。
方法：免疫抑制法、免疫沉淀法、放射免疫测定（RIA）、化学发光免疫测定（CLIA）、酶免疫测定（EIA）、荧光酶免疫测定（FEIA）等。 前两种方法可用于酶活性浓度测定，其他方法则用于酶蛋白浓度测定。 酶活性浓度单位常以U/L报告， 酶质量（mass）浓度单位常直接用ng/ml或g/L报告。

47 二、优点 灵敏度高 特异性高 能用于检测一些不表现酶活性的酶蛋白 特别适用于同工酶的检测 样品中其他方法不易测出的少量或痕量酶
不受体液中其它物质的影响 酶原或去辅基酶蛋白 灵敏度高 特异性高 能用于检测一些不表现酶活性的酶蛋白 特别适用于同工酶的检测

48 三、缺点 要制备足够量多的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清 步骤多，操作繁琐 测定成本高

49 第 六节 同工酶及其亚型测定

50 一、概念 同工酶（isoenzyme） 同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。 亚型（isoform） 即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶，往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。

51 二、分析方法 临床同工酶的分析可分为两步 首先精确地分离出某酶的各同工酶组分 测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性

52 二、分析方法 （一）电泳法 原理 方法 同工酶氨基酸组成不同（一级结构不同），pI不同，电泳迁移率也就不同，电泳可将其分开。 使用最为广泛
简便、快速、分离效果好、不破坏酶的天然构象 可分为：乙酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳 测定步骤为：区带分离、活性显色和检测结果

53 显色染料 扫描定量 离子型化合物，易溶于水，难溶于一般的有机试剂，利用其进行的偶合反应，生成不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测
受氢体作用，四唑盐可被还原成紫红色的formazan，常用的有：NBT、INT、MTT等。其中NBT使用最多。 显色染料 偶氮染料 四唑盐 扫描定量 光密度计 荧光计

54 LDH同工酶

55 乳酸脱氢酶同工酶活性染色 用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：

56 电泳结果实例 LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2

57 注意事项 用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。
巨酶：血浆中有时可出现相对分子质量远大于正常酶分子的一些酶，通常称为巨分子酶或酶的大分子形式，简称为巨酶（macroenzyme）

58 巨酶形成原因 酶与免疫球蛋白形成的复合物 酶与其他蛋白质形成的复合物 酶亚基或酶分子之间形成的聚合物
巨酶因其分子量大,在体内不易排出,也不易被巨噬细胞系统吞噬而降解,所以在血中存留时间较长，可引起酶测定结果偏高。 当临床症状不明显，酶活性不正常，同工酶图谱异常时要考虑是否有巨酶。

59 （二）色谱法 柱色谱法 离子交换色谱 亲和色谱 商品化微型色谱柱

60 （三）免疫分析法 免疫抑制法 免疫沉淀法 其它免疫学方法
利用同工酶的一种亚基与相应抗体结合后，酶活性受到抑制，测定加与不加抗体前后样品中酶活性的变化 利用分离提纯的同工酶作抗原制备的抗体与含该型同工酶的待测样品混合，在一定条件下抗原抗体复合物形成沉淀，离心后测定上清液中其它型别的酶活性，将加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。 （三）免疫分析法 免疫抑制法 免疫沉淀法 其它免疫学方法 免疫电泳、RIA、EIA和CLIA

61 （四）动力学分析法 底物特异性分析法 抑制剂分析法 pH分析法 热失活分析法

62 有些同工酶有明显的组织分布和细胞内定位差异
三、同工酶检测意义 有些同工酶有明显的组织分布和细胞内定位差异 提高酶诊断的特异性 提高诊断的灵敏度 对某些疾病的预后有评价价值 有些同工酶的变化可在总酶变化之前发生 线粒体酶的测定

63 第七节　工具酶及其临床应用 通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。 Ex Ea Ei A B C P

64 (一) 常用工具酶及其质量要求 １、多为氧化还原酶类——其产物最易被直接监测 ２、在反应中，主要限速因子应该是待测化合物和待测酶，要求工具酶和其辅助底物应过量。 ３、纯度不必太高——成本。 ４、工具酶试剂中和杂酶和抑制剂的含量有一定的限制。

65 （三）工具酶参与的指示反应 1. 偶联H2O2的工具酶及其指示反应
临床生化检验中，很多项目的测定往往使用有工具酶参与的类似的反应原理－－共通（通用）反应途径。 1. 偶联H2O2的工具酶及其指示反应 葡萄糖氧化酶 尿酸氧化酶 胆固醇氧化酶 甘油氧化酶 丙酮酸氧化酶 触酶 POD 葡萄糖 尿酸 胆固醇 甘油 丙酮酸 以H（e）为受体的指示酶 以NAD(P)H为辅酶参与的指示酶 H2O2 (最常用） 2H2O2+4-AAP+酚 醌亚胺(红色)+4H2O POD

66 H2O2＋4-AAP＋酚 H2O＋O2＋红色醌类化合物
例：葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 GOD Glu＋O2＋H2O GA＋H2O2 H2O2＋4-AAP＋酚 H2O＋O2＋红色醌类化合物 POD 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）利用O2和H2O将Glu氧化成GA，并释放H2O2 ，过氧化物酶（peroxidase，POD）在色原性氧受体存在时将H2O2分解为H2O和O2 ，并将色原性氧受体4-AAP和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应。红色醌类化合物的量与Glu含量成正比。 即POD催化下， H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色色素，此类色素原供氢体包括：OT、DAB、ODA、TMB。

67 P+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P) +
2. NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应 许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶如LD、GLD、G6PD等参与时，常将底物的H去除后传递给NAD (P)+形成NAD(P)H。借助NAD(P)H340nm处特征性的光吸收，借此用分光光度法检测。 如：葡萄糖、尿素、β-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、 ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、ICD等。 P+NAD(P)H+H PH2+NAD(P) + 尿素＋H2O NH3＋CO2 NH3＋ α-酮戊二酸 ＋NADH＋H 谷氨酸＋NAD+＋H2O 尿素酶 GLD 例：

68 二、代谢物的酶法测定 终点法 在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终点法（又称平衡法）。

69 测定的基本条件 1.待测物浓度[S]应远小于其米氏常数Km，此时任何时刻的反应速度 v=V[S] / Km，呈一级反应。
2.反应配方中所用酶量（V）应足够大，而Km应小，以保证有较快的反应速度完成测定。

70 终点法的类型-直接法 待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，这种是最简单的代谢物浓度测定方法。
如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在293nm有特异的吸收峰， 胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿素造成450nm处的吸光度下降等。

71 终点法的类型-酶偶联法 酶偶联法 与酶活性测定一样，直接法测定的项目是有限的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测方法。
如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反应主要分两大类：NAD（P）H和过氧化物酶（POD）系统。

72 动力学法 概念： 根据米氏方程，当[S]<<Km，一般[S]/Km<0.2，最好
<0.05，[S]+Km≈Km，此时呈一级反应，反应初速 度v=k[S]。如果能准确测定反应的初速度（v），采用标 准浓度对照法即可求得待测物的浓度。 实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只 要此期间待测物消耗<5%，就可以采用标准浓度对照法计 算样本浓度，所以动力学法有时又称为定时法。

73 终点法与动力学法的主要区别 与终点法相比，动态法测定中待测物无需完全转化，故工具酶的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的Km应足够大。 两者对于测定仪器的要求不同。终点法测定对于仪器的电噪声和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读准到0.0001，温度变化<0.1%。 产物的堆积和样品色原对动态法影响较小，而对终点测定法影响较大。如碰到乳糜或溶血，在做终点法测定时，有时需设样本空白。

74 第八节 临床常用血清酶、同工酶

75 一、转氨酶（ Aminotransferases ）及其同工酶
丙氨酸氨基转移酶 (Alanine aminotransferases，ALT) / 谷丙转氨酶 GPT 天冬氨酸氨基转移酶 (Aspartate aminotransferases，AST/ 谷草转氨酶 GOT 1.催化反应 L-丙氨酸＋α-酮戊二酸 α-丙酮酸＋ L-谷氨酸 L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸 α-草酰乙酸＋ L-谷氨酸 ALT AST 两种酶均需要磷酸吡哆醛（VitB6）为辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白为脱辅基酶蛋白，无催化活性。

76 2.组织分布 ALT大量存在于肝组织，其次为肾、心、骨骼肌等。其有两种活性同工酶，α(ALTs)、β(ALTm)，分别存在细胞质及线粒体中。肝细胞中ALT大多存在细胞质，少量在线粒体，肝细胞坏死时血清中以ALTs为主。 AST存在多种器官，按含量多少为心、肝、骨骼肌和肾。其有两种同工酶ASTs、ASTm，分别存在细胞质及线粒体中。细胞轻度损伤ASTs显著升高，而严重损伤时ASTm 大量出现于血清中。血中AST升高多来自心脏或肝脏损伤。

77 3.标本 4.临床意义 溶血标本不能用于检测 宜用血清，4℃ 冰箱中可贮存1星期，活性无明显改变。 ALT是反映肝损伤的一个灵敏指标
急性肝炎早期升高，ALT>AST； 急性肝炎恢复指标 Deritis比值可用于肝炎诊断、鉴别诊断及判断转归 酶胆分离是肝细胞坏死先兆

78 AST主要用于肝脏疾病的诊断 AMI发病6-8h即升高，48-60h达高峰，4-5d恢复正常。由于AST在AMI时升高迟于CK，恢复早于LD，故目前诊断AMI价值不大。 急性肝炎，AST升高程度不及ALT；慢性肝炎，特别肝硬化、慢性活动性肝炎时，AST升高程度超过ALT。

79 二、 γ-谷氨酰转移酶及其同工酶 γ-谷氨酰转移酶 （ γ- glutamyl transpeptid, γ- GT/GGT） 又称：γ-谷氨酰转肽酶 （ γ-GTP/GGTP) 1. 催化反应 一种含巯基的线粒体酶，可催化γ-谷氨酰基从GSH或其它含γ-谷氨酰基化合物中转移至另一肽或氨基酸分子上。 GGT GSH＋氨基酸 γ-谷氨酰氨基酸＋半胱氨酰甘氨酸

80 2. 组织分布 3. 标本 肾脏中含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的GGT主要来自肝胆。
GGT较稳定，室温下可放置2d， 4℃可存放1w， -20℃可储存1y；RBC中几乎无GGT，因此溶血标本可以检测。

81 胆道疾病，GGT阳性率高，而且升高明显，可高达5-30ULN，肝实质疾病是GGT一般只是中度升高，可达2-5ULN。
若ALP升高而GGT正常，则完全排除ALP的肝来源，若ALP和GGT都增加，则应先排除肝外引起GGT增加的原因，一旦排除，则GGT增高为肝病所致。 胆道疾病，GGT阳性率高，而且升高明显，可高达5-30ULN，肝实质疾病是GGT一般只是中度升高，可达2-5ULN。 4. 临床意义 (1) 肝胆疾病检出阳性率最高的酶 有助肝胆疾病的鉴别诊断 与ALP联合进行肝脏疾病检测 (2) 用于判断恶性肿瘤有无肝转移 (3) 乙醇、巴比妥类药物等可诱导GGT的升高。

82 肌酸激酶 （creatine kinase，CK）
三、 肌酸激酶及其同工酶和亚型 肌酸激酶 （creatine kinase，CK） 1. 催化反应 CK催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之间的磷酸转移的可逆性反应，所产生的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。 磷酸肌酸＋ADP 肌酸＋ATP CK

83 2. 组织分布 广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑。CK由两种不同亚基（M，B）组成的二聚体，细胞质中存在三种同工酶：CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2)、CK-MM(CK3)，线粒体中存在CK-Mt(CK4)，其电泳速率最慢。 CK同工酶又可分为不同亚型，CK-MM有三种亚型，CK-MM1，CK-MM2，CK-MM3，电泳速率依次减慢；CK-MB有CK-MB2和CK-MB1两种亚型。 3. 标本 不得用溶血标本，RBC中含有AK，可干扰测定，引起测定值偏高；测定样品宜用血清或肝素抗凝血浆，其它抗凝剂都抑制CK活性。

84 4. 临床意义 CK及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断。 (1) AMI的早期诊断
CK-MB为诊断AMI的金指标 CK-MM3/CK-MM1>1.0为诊断AMI的标准（排除急性骨骼肌损伤） CK-MB2>1.9U/L或CK-MB2/CK-MB1>1.5为诊断AMI的标准之一 (2) 全身疾病特别是肌肉疾病时，CK极度升高

85 乳酸脱氢酶 （lactate dehydrogenase，LD/LDH）
四、乳酸脱氢酶及其同工酶和亚型 乳酸脱氢酶 （lactate dehydrogenase，LD/LDH） 1. 催化反应 LD催化乳酸氧化成丙酮酸，同时将氢转移给辅酶而成为NADH，依条件不同而有可逆性。 L-乳酸＋NAD 丙酮酸＋NADH＋H+ pH8.8～9.8 Ph7.4～7.8

86 1.以LD1为主，主要在心肌，可占总LD活性50％以上，也存在于RBC内；
2. 组织分布 LD是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于人体各组织中，以肝、心肌、肾、肌肉、RBC含量最高。 LD是由两种不同亚基（M和H）组成的四聚体，形成5种结构不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。 1.以LD1为主，主要在心肌，可占总LD活性50％以上，也存在于RBC内； 2.以LD5为主，以横纹肌为代表，肝脏中也有； 3.以LD3为主，存在于脾肺。 一般成年人血中LD同工酶存在如下规律：LD2>LD1>LD3>LD4>LD5，部分正常儿童血中可见LD1>LD2。

87 3. 标本 一般用血清，用血浆需离心去除血小板（血小板中含有大量的LD），采血后迅速分离血清；因RBC中LD含量比血清高100倍以上，不宜用溶血标本。 LD4、LD5宜冷变性，不应放在冰箱中，25 ℃放2-3d，LD活性变化不大。

88 4. 临床意义 (1) 诊断心脏疾病 亚急性心肌梗死诊断有一定价值，但其特异性差；
4. 临床意义 (1) 诊断心脏疾病 亚急性心肌梗死诊断有一定价值，但其特异性差； 心肌梗死和心肌炎时以LD1和LD2升高为主，大多数AMI患者血中会出现“反转比率”，即LD1>LD2； (2) 诊断肝脏疾病 肝细胞损伤时常出现LD5>LD4; 急性肝炎时LD1LD2相对下降，LD5升高；慢性肝炎时LD5升高，且LD1<LD3；肝硬化时为LD2下降和LD5升高；肝癌时LD5升高，但LD1>LD3； (3) 诊断骨骼肌疾病 骨骼肌损伤时常出现LD5>LD4;

89 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP/AKP）
五、碱性磷酸酶及其同工酶 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP/AKP） 1. 催化反应 一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（pH10.0）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物。 2. 组织分布 ALP广泛存在于各组织器官中，其含量以肝脏为最多，其次为肾、胎盘、小肠和骨骼等。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。 生长期儿童血清内ALP主要来自成骨母细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。

90 3. 标本 空腹采血，避免脂肪餐的影响；样品用血清，不能用明显溶血标本；在室温或冰箱放置，活性逐渐升高，可增加5-10％，应在采血当日测定。 4. 临床意义 (1) 诊断骨骼性疾病 很多骨骼疾病如变形性骨炎等患者血中ALP升高，我国常用于早期诊断佝偻病和软骨病。 (2)诊断肝胆系统疾病，尤其是黄疸 急性肝炎时ALP增高达2-5ULN，肝硬化、胆石症和肿瘤引起的胆汁淤积，ALP增高达5-20ULN。90％以上肝外胆道阻塞患者血清ALP升高，升高程度和阻塞程度、病变程度成正比。

91 酸性磷酸酶 （acid phosphatase，ACP）
六、酸性磷酸酶及其同工酶 酸性磷酸酶 （acid phosphatase，ACP） 1. 催化反应 作用类似ALP的磷酸酶（最适pH在7.0以下） 2. 组织分布 ACP存在于人体不同组织，如前列腺、红细胞、血小板、肾脏、肝脏、脾脏、胃、肌肉及骨髓中，以前列腺含量最多。正常男性血清中ACP约有1/3-1/2来自前列腺。 3. 标本 血清或肝素抗凝血浆，37 ℃ 或偏碱时灭活很快，pH降至6.5以下，酶比较稳定。

92 临床意义 主要用于诊断前列腺癌，血清ACP显著上升，转移性癌患者可达40-50ULN。由于ACP不稳定，测定困难，目前正被其它前列腺标志物如PSA所取代。

93 淀粉酶 （amylase，AMY/AMS）
七、淀粉酶及其同工酶 淀粉酶 （amylase，AMY/AMS） 1. 催化反应 将多种糖化合物，如淀粉、肝糖原等水解成糊精、麦芽糖和少量葡萄糖等产物的一组酶。 2. 组织分布 人体胰腺含AMY最多，唾液腺也分泌大量AMY入口腔，还见于卵巢、肺、睾丸、横纹肌和脂肪组织中。 AMY是一种需钙金属酶，其最适pH在 之间，卤素和其它阴离子有激活作用。

94 3. 标本 4. 临床意义 多用血清或肝素抗凝血浆，其它抗凝剂都有抑制作用，不宜用去钙血浆测定AMY。
(1) 评价胰腺外分泌功能的一种辅助诊断指标。 (2) 急性胰腺炎早期检测血AMY，在后期测定尿AMY更有价值。 (3) AMY诊断胰腺炎其增幅与病情不成比例时，常预示坏死性胰腺炎。

95 八、脂肪酶 脂肪酶 （lipase，LPS/LIP） 胰腺外分泌酶，血清中LPS主要来自胰腺，少量来自胃肠粘膜。
LPS在急性胰腺炎时活性升高的时间早，上升的幅度大，持续的时间长，其诊断价值高于AMY。 临床发现，凡血清AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高。

96 胆碱酯酶 （choline esterase，ChE）
九、胆碱酯酶 胆碱酯酶 （choline esterase，ChE） 一类催化酰基胆碱水解的酶类，人体内有两种。 ChE在肝脏合成后立即释放到血浆中，为评价肝细胞合成功能的灵敏指标。各种肝病，病情越差，血清ChE活性越低，持续降低无回升迹象者多预后不良。

97 临床各系统疾病的酶学诊断 一、肝脏疾病 二、骨骼及骨骼肌疾病 诊断肝实质细胞受损的酶：AST ALT LD(LD5)
反映肝细胞合成功能的酶：ChE LCAT 凝血酶原 诊断肝纤维化的酶：MAO 诊断胆道梗阻的酶：ALP GGT 5`-NT 二、骨骼及骨骼肌疾病 诊断骨骼疾病：ALP 诊断骨骼肌疾病：CK(CK- MM) AST LD (LD5)

98 三、胰腺疾病 四、前列腺疾病 五、心肌酶谱 AMY LPS ACP PSA CK-MB：AMI诊断的金指标 ASTm：判断预后
LD：LD1>LD2

99 思考题 1何谓酶活性浓度？检测方法有哪几种？ 2 简述酶促反应时间进程的分期及各期特点。 3简述终点法与酶学动力法的区别。
4简述常见几种血清酶的检测意义。

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