免疫血清的制备.

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1 免疫血清的制备

2 概述 第一节 抗血清的制备 一、免疫动物的选择 二、免疫程序 三、动物采血法 第二节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存 第三节 抗血清的纯化 一、特异性IgG抗体 二、单价特异性抗血清

3 免疫血清的概念 利用微生物及其代谢产物等特异性抗原作为免疫原，经反复多次注射同一动物体，这样所生产的含有特异性抗体的血清，被称为免疫血清或高度免疫血清，亦称为抗血清。 使用这种通过人工免疫法获得的免疫血清，可治疗或预防某些相应的疾病，并且具有很高的特异性。 用作被动免疫，对相应传染病进行治疗或紧急预防，效果佳良，是紧急防疫和治疗药品中的一种特效制剂。

4 免疫血清的作用机理 高度免疫血清之所以具有预防和治疗急性传染病的作用，是由于它含有特异性免疫球蛋白—抗体。
抗病血清或抗毒素血清，具有很强的特异性，一种血清只对相应的一种病原微生物或毒素起作用。

5 免疫血清的种类 根据免疫血清作用的对象不同，可将其分为抗病血清和抗毒素两类。
近几年来，卵黄抗体已成为免疫血清的重要替代品，而且越来越受到人们的重视。卵黄抗体可以在一定程度上克服血清抗体成本较高、生产周期较长的弱点，并且具有用同批动物连续生产的优点。 目前生产较多的抗病血清有：抗猪瘟血清、抗炭疽血清、破伤风抗毒素，此外还有禽用的小鹅瘟血清、小鸭肝炎血清和法氏囊病血清。抗毒素包括破伤风抗毒素、肉毒抗毒素以及抗大肠杆菌肠毒素等。

6 免疫血清的应用 目前，虽然免疫血清的生产量不大，但是抗病血清的特殊作用仍是不容忽视的。有些病的治疗虽然可以使用抗生素类制剂，而要彻底控制和消灭传染病，在特定情况下，抗病血清的作用是抗生素不能全部代替的。 免疫血清用作紧急预防注射，通常是在已经发生传染病或受到传染病威胁的情况下使用，其优点是注射后立即产生免疫，疫苗是起不到这种作用的。但是这种免疫力维持时间较短，一般仅2-3周，因此，在注射血清后2-3周仍需再注射一次疫苗，才能获得较长时间的抗传染能力。 在人工被动免疫中，以抗毒素血清的效果最佳，应用最广，如破伤风抗毒素、肉毒抗毒素和葡萄球菌抗毒素等。抗毒素血清必须早期应用才能效果显著，如果症状十分明显之后，即使大量应用也效果极差。

7 免疫血清的基本制备过程 动物的选择 制定免疫程序 免疫原的生产 血液的采集与血清的提取 免疫 纯化 测试、分装、保存 检验

8 第一节 抗血清的制备 抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体

9 多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物
多克隆抗体的产生示意图

10 多克隆抗体 抗原 克隆A 表位A 表位B 克隆B 表位C 单克隆抗体 克隆C

11 一、免疫动物的选择 抗原来源与动物种属的关系 动物个体的选择 抗原的性质 按需要量选择大小不同的动物。
种属差异越远，免疫原性越强 动物个体的选择 适龄、健康、体重符合要求 抗原的性质 按需要量选择大小不同的动物。 能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类 如兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。

12 二、免疫程序 免疫原的剂量 免疫间隔时间 免疫途径 中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天 免疫途径 皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结

13 二、免疫方法 免疫方法 1.免疫原的注射剂量 2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉＞ 腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内＞淋巴结＞足掌 3.免疫方案
①全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 ②微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月 抗原 ③混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉

14 三、动物采血法 颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊

15 第二节 抗血清的鉴定和保存

16 一、抗血清的鉴定 抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法 抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA
抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE 、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验

17 二、抗血清的保存 2℃～8℃保存：短期保存 冰冻保存：保存5年 真空干燥保存：保存5～10年

18 第三节 抗血清的纯化 抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。

19 一、特异性IgG抗体 盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法
离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层析柱

20 二、单价特异性抗血清 亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗 原混合液制成固相吸附剂

21 （一）破伤风抗毒素 几种重要免疫血清的制造
选择5-12岁营养良好的马匹，先用破伤风类毒进行基础免疫，第一次注射精制破伤风类毒素油佐剂抗原1m1（或明矾沉降类毒素10ml），第二次注射2ml（或明矾沉降类毒素20ml），1-3个月后进行高度免疫。 第一程高度免疫注射5-8次，第1-4次每次间隔2-3天；第5-8次每次间隔4-6天。抗原量每次递增1-2m1。第五次开始试血至第八次。最后一次免疫后6-7天采血，隔1天再次采血，检测效价。抗毒素效价每毫升不低于1200单位（AE）。 第一程采血后，休息14-16天，进行第二程免疫，一般免疫3次，间隔5-7天，最后一次免疫后7-9天采血。 破伤风血清，用胃酶消化，按次序加入15%、20%硫酸铰进行沉淀，然后加入10%的明矾使明矾含量为1%，静置使之沉淀。取沉淀后的上清加38%的硫酸铵沉淀，沉淀物经透析即成精制破伤风抗毒素。

22 破伤风抗毒素高度免疫程序表 程 次 日 期 抗原计量（ml） 备 注 I 1 3 2 5 8 4 11 5-6 试 血 15 6-7 20
程 次 日 期 抗原计量（ml） 备 注 I 1 3 2 5 8 4 11 5-6 试 血 15 6-7 20 7-8 25 8-10 1（下月） 采 血 II 18-20 23-25 28-30 6

23 （二）抗炭疽血清 选择健壮马匹，先用炭疽疫苗（无毒炭疽芽胞苗或II号炭疽芽胞苗）于1、9、11、13日共进行4次基础免疫。然后，进行高度免疫：于第15、17、19、21、23、25、27、29、31，33、35、37日共高免12次、剂量由0.2ml递增至150m1。 高度免疫可用炭疽强毒，也可用炭疽疫苗，二者在免疫程序上略有差别。第45日试血，试血合格后，再接最后一次的剂量免疫一次，7-8天后采血分离血清，加防腐剂，密封于冷暗处，静置1-2个月使之澄清，经检验合格后分装。

24 （三）抗小鹅瘟血清 小鹅瘟只感染3-20日龄雏鹅，不能引起成年鹅发病。将小鹅瘟病毒免疫成年鹅，第一次用1:100稀释的病毒液（鹅胚尿囊液）1ml皮下接种，几天后注射未经稀释的病毒液（鹅胚尿囊液原毒）1m1，经15天后放血致死，分离血清，即为高免血清，加0.01％硫柳汞防腐。 血清要进行安全检验和效力检验。分装后冷藏。预防量每只雏鹅0.5m1，治疗量每只2-3m1。

25 （三）卵黄抗体的制备与提纯 目前国内使用的疫苗还不能完全有效地控制某些鸡病（如鸡传染性法氏囊病，IBD）的流行，又无相应的高免血清，故在此种情况下，制备高免卵黄抗体液进行现地防治，常能收到较好效果。 以IBD为例，其卵黄抗体液的制备过程是，选择健康无病的产蛋鸡群，以免疫原性良好的油佐剂灭活苗对开产前或已开产的蛋鸡，每只肌肉注射2m1，7-10日后，重复注射一次，再过7-10日再注一次，油苗剂量适度递增，第三次免疫后定期检测卵黄抗体水平，待琼扩效价达1:128时开始收集高免蛋，4C贮存备用，琼扩效价降到1:64时停止收蛋。高免蛋合格时间大约持续一个月。

26 （三）卵黄抗体的制备与提纯 将高免蛋用0.5%新洁尔灭溶液浸泡或清洗消毒，再用酒精棉擦拭蛋壳，打取鸡卵分离蛋黄。根据卵黄抗体琼扩效价水平加人生理盐水进行稀释(稀释后的卵黄抗体琼扩效价不低于1：16-1：32)，加青、链霉素各1000U （g）/m1，加硫柳汞浓度达0.01%，充分搅拌后分装于灭菌瓶内4C 贮存。每批都进行效价测定、细菌培养和安全试验。