实验三：线粒体及液泡系的活体染色 【实验目的】 1.通过制片掌握活体染色方法； 2.熟悉在耳缘静脉用空气栓塞处死兔子的方法；

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1 实验三：线粒体及液泡系的活体染色 【实验目的】 1.通过制片掌握活体染色方法； 2.熟悉在耳缘静脉用空气栓塞处死兔子的方法；
3.了解线粒体及液泡系在光镜及电镜下的基本形态结构

2 【实验原理】 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

3 【实验原理】 根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

4 【实验原理】 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，他们彼此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，Janus green B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

5 【仪器、材料与试剂】 （一）仪器 显微镜,载玻片,盖玻片,刀片,吸水纸镜头纸,恒温 水浴锅,解剖盘,剪刀,表面皿,牙签,凹面载玻片
（二）材料 小白鼠肝细胞或兔子的肝脏细胞    小麦或黄豆幼 根根尖 （三）试剂 Ringer溶液 10%、1/3000中性红溶液 1%、 1/5000Janus green B溶液

6 【实验步骤】 （一）兔肝细胞线粒体的活体染色
1.用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压). 2.用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。

7 【实验步骤】 3.当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。 染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。 4.将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。 5.显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。

8 (二)植物细胞液泡系观察 1.取豆芽的根尖,用刀片综切根尖. 2.放入中性红染液中,染色5-10min 3.吸去染液,滴一滴Ringer液.
4.盖上盖玻片进行镜检. 5.在高倍镜下,先观察根尖部分的生长点细胞,可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡,这是初生的幼小液泡.然后,由生长点向延长区观察,在一些已分化的细胞内,液泡的染色较浅,体积增大,数目变少.在成熟区细胞中,一般只有一个淡红色的巨大液泡,占据细胞的绝大部分,将细胞核挤到细胞一侧.

9 【实验报告】 画出你所观察到的线粒体和液泡的图像. 总结实验成功或失败的原因.

10 【思考题】 1. 用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器？
1. 用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器？ 2. 小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延长区细胞中液泡数量变少，染色浅？ 3. 为什么要取兔肝边缘较薄的肝组织