第二章 基因工程制药.

Presentation on theme: "第二章 基因工程制药."— Presentation transcript:

1 第二章 基因工程制药

2 前言：基因工程的基础知识 一、基因的概念: DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。
早期认为遗传物质是蛋白质，1944年Avery从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。

3 二、基因的一般特性： ①基因可自我复制， ②基因决定蛋白质结构， ③基因可突变。 基因按功能分为： ①结构基因 ②调控基因

4 三、DNA的结构与性能 ⒈DNA的结构：四种核苷酸（A T C G）连接。DNA二级结构为双螺旋结构。 ⒉DNA的性质与功能
①吸收光谱260 ②电场中泳动 ③变性 复性 杂交

5 四 DNA的复制与表达 （一）、DNA的复制： 　　半保留复制

6 二、基因表达 ⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。 转录后加工： 剪切：除去内含子 加帽：5’加m7Gppp
加尾：3’加poly（A）

7 二、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程。
⒈分为三个阶段： ①起始 ②延长 ③终止

8 第二章 基因工程制药 1-4节

9 第一节 概 述 20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。 1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。
第一节 概 述 20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。 1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。 优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足 。

10 第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。

11 基因工程基本过程

12 基因工程药物制药的主要程序 ⒈目的基因的克隆， ⒉构建DNA重组体， ⒊DNA重组体转入宿主菌， ⒋构建工程菌， ⒌工程菌发酵，
⒍表达产物的分离纯化， ⒎产品的检验等。

13 基因工程药物制药的主要程序 获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞） 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装

14 第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法
第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。

15 ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定

16 二、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。
用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。

17 人工化学合成基因的限制 ⒈不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 50～ 60 bp，因此
只适用于克隆小分子肽的基因。 ⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。 ⒊费用高。

18 筛选基因的其他方法 1 编码序列富集法 2 岛屿获救PCR法 3 动物杂交法 4 功能克隆法 5 构建cDNA文库 6 差异显示技术

19 第四节 基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
第四节 基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。

20 最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。

21 一、宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素；

22 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；
容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。

23 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。

24 ⒈ 原核细胞 ⑴大肠杆菌 因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。

25 表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。

26 因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
蛋白质不能糖基化。 产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 其内毒素很难除去。

27 ⑵枯草芽胞杆菌 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。

28 ⑶链霉菌 作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。

29 ⒉真核细胞 ⑴酵母 酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达

30 ⑵丝状真菌 优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。

31 目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母,已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。

32 二、大肠杆菌中的基因表达 载体 基因工程的目的和基本手段，是选用合适的载体把供体DNA（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。

33 基因工程载体分为： 克隆载体 转录载体 表达载体 克隆载体 转录载体 表达载体 DNA DNA RNA 蛋白质

34 原核细胞的基因组特点： ①染色质为环状双股DNA分子 ②具有操纵子结构 ③结构基因多为单拷贝 ④特定区域分布特异DNA顺序 因此外源DNA分子可以插入原核细胞DNA复制体系的特定区段

35 　基因工程克隆载体的特点： 　①具有复制子 　②有单一限制内切酶切位点或多克隆　位点 　③有选择性遗传标记如抗药基因 　④拷贝数高 　⑤生物安全性好

36

37 目前使用的载体按特性可分为： ①质粒 ②λ噬菌体 ③黏性质粒 ④M13噬菌体 ⑤酵母 ⑥真核细胞病毒载体

38 细菌质粒的生物学特性 质粒的定义： 质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双股DNA分子，具有独立自主复制和调控能力，可赋予宿主细胞一定的生物性状。

39 质粒的生物学特性 ①大小 小型质粒1.5～15kb , 大型质粒60～120kb ②复制类型: 严紧型质粒, 松弛型质粒 ③拷贝数
④电泳特点 ⑤不相容性

40 质粒的分类: ⒈按复制型式①严紧型 ②松弛型 ⒉按基因转移性①传递性质粒 ②非传递性质粒 ⒊按遗传性状产物分类: ①抗生素抗性 ②限制酶修饰酶系统

41 ⒈ 真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：
⑴载体能够独立复制。载体本身是 一个复制子，具有复制起点。 ⑵应具有灵活的克隆位点和方便的 筛选标记，以利于外源基因的克 隆鉴定和筛选。

42 ⑶应具有很强的启动子，能为 大肠杆菌RNA聚合酶所识别。 ⑷应具有阻遏子，使启动子受 到控制，只有当诱导时才能 进行转录。

43 ⑸应具有很强的终止子，只转录 克隆的基因，所产生的mRNA较为 稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有翻译的 起始信号AUG和SD序列，以便转录 后顺利翻译。

44 常用表达载体 -- 质粒pBV220的结构 pBV220系统国内使用最多的载体,其组成: ①来源于pUC8多克隆位点
②核糖体rrnB基因终止信号 ③pBR322第4225～3735位 ④pUC18第2066～680位 ⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子 ⑥pRC23的PL启动子及SD序列

45 pBV220系统优点： ①cIts857抑制子基因PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。 ②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白； ③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；

46 ④整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；
⑤PR和PL启动子串联，可以增强启动作用；

47 本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要。
本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%～30%； 产物以包含体形式存在不易降解均一性好；

48 pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。
该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白具有与IgG结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。

49 融合表达质粒pBG-2的结构

50 ⒉影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于： ⑴外源基因的拷贝数

51 ⑵ 外源基因的表达效率 ①启动子的强弱 ②核糖体接合位点的有效性 ③SD序列和起始密码ATG的间距 ④密码子组成

52 ⑶表达产物的稳定性 ⑷细胞代谢负荷 ⑸工程菌的培养条件

53 ⒊真核基因在大肠杆菌中的表达形式 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；
⑴以融合蛋白的形式表达药物基因 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达； 缺点：只能作抗原用。

54 ⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏。

55 ⑶分泌型表达药物基因 优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨酸残基； 缺点：产量不高， 信号肽不被切割。

56 三、酵母中的基因表达 ⒈载体 酵母载体可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代DNA和RNA单位。

57 ①Yep类（yeast episomal plasmid， ②YRp类（yeast replication plasmid，
⑴ 载体的复制系列可分四类： ①Yep类（yeast episomal plasmid， 酵母附加体质粒） ②YRp类（yeast replication plasmid， 酵母复制型质粒） ③YCp类（yeast centromeric plasmid， 酵母着丝粒质粒） ④YIp类（yeast integrative plasmid， 酵母整合型质粒）

58 ⑵ 克隆载体 ⑶ 表达载体 ①普通表达载体 ②精确表达载体

59 ⒉影响目的基因在酵母菌中表达的因素 ⑴外源基因的拷贝数 ⑵外源基因的表达效率 　①启动子 　②分泌信号的效率 　③终止序列的影响

60 ⑶外源蛋白的糖基化 ⑷宿主菌株的影响 　①菌体生长力强 　②菌体内源蛋白酶要较弱 　③菌体性能稳定 　④分泌能力强

61 四、动物细胞中的基因表达 哺乳动物细胞外源基因表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养 液中，使产物易纯化。 基因产物糖基化接近天然产物。

62 细胞生长慢，生产率低， 条件刻苛，费用高， 培养液浓度较小。 表达的外源细胞均为传代细胞 表达产物是否致癌尚有疑问。

63 主要基因工程表达体系比较 表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性
表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性 大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 容易 一般 对原核好 不大 融合蛋白质 部分高产 对真核差 酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高产 稍复杂 天然产物 哺乳动物 完 整 外分泌 较难成本高 简单 可达天然 需注意 糖基化蛋白 可高产 产物 致癌