中药与天然产物活性成分的分离纯化 ——技术与策略.

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1 中药与天然产物活性成分的分离纯化 ——技术与策略

2 生命科学与生物药物的发展 色谱 基因组 蛋白质组 次生代谢产物组 DNA RNA 蛋白质（酶） 基因工程药物 中药活性成分 次生代谢产物
天然产物活性成分

3 中药与天然产物研究存在的问题 化学成分复杂 有效成分种类很多：生物碱、甙、黄酮、醌、多酚、内脂、香豆素、 数种有效成分并存，并一起作用
萜、有机酸、寡糖、多糖、环肽、甚至蛋白质 数种有效成分并存，并一起作用 合成前体相同，配基链长不等 手性特征差异 含量很低

4 中药与天然产物分离纯化技术 提取 溶剂分配 超临界萃取 气相色谱 液相柱色谱 高速逆流色谱 New 分离操作 分析或半制备，亲脂性物质
分析，低沸点物质 New 分析、制备、生产，亲水性、亲脂性物质 分析、半制备，亲脂性物质

5 色谱技术的应用 存在的问题 需要全面发展色谱技术 大孔吸附树脂 离子交换色谱 天然产物色谱纯化理论滞后 研究方法替代生产工艺的模式
工艺技术单一 正相层析（硅胶和大孔树脂） 反相层析（C柱）、配合结晶技术 需要全面发展色谱技术 大孔吸附树脂 离子交换色谱 分子排阻色谱 亲和色谱 反相色谱 高速逆流色谱

6 分离纯化策略 涉及分离技术选择的因素 配合各种色谱技术是解决问题的最佳途径 提取的方法 提取物或混合物样品的复杂程度 样品的制备 样品的极性
样品的稳定性 样品的溶解度 样品量 分离技术的互补性 配合各种色谱技术是解决问题的最佳途径

7 分离纯化策略—— 亲水性化合物 大孔吸附树脂 离子交换色谱 亲水性分子排阻色谱 亲和色谱

8 分离纯化策略—— 亲水性化合物 大孔吸附树脂 快速、高效、成本低 适宜于单味药某类成分某极性段的单向提取
分离纯化策略—— 亲水性化合物 大孔吸附树脂 快速、高效、成本低 适宜于单味药某类成分某极性段的单向提取 不方便、不适于工艺放大：以聚苯乙烯为骨架，含有小分子致孔剂、交联剂等，在提取物中有较大残留。 吸附量下降至30％以上则不宜于再使用。 主要用于含生物碱、皂苷、蒽醌、水溶性酚性物质等中药单方或复方。

9 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 典型的高选择性层析，分辨率高，载量大，工艺控制简单，规模容易放大
分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 典型的高选择性层析，分辨率高，载量大，工艺控制简单，规模容易放大 具有显著的浓缩效果，能够从含量低的大量样品中捕捉目标 ，适合于初步纯化 再生能力强 阴离子交换 多糖、肽类、皂甙等具有生物活性物质，需要温和分离纯化条件 生物酸、生物碱等较强极性，对离子交换色谱选择性高的物质 阳离子交换

10 + - 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 binding to cation exchanger net pka charge
分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 R-NH2, pKa=8.0 pH<8.0, R-NH3+ pH>8.0, R-NH2 + binding to cation exchanger net pka charge 2 pH 10 binding to anion exchanger - R-COOH, pKa=5.0 pH<5.0, R-COOH pH>5.0, R-COO-

11 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换树脂 有机酸 糖 糖醇 甙类 甾类、萜类及多环化合物 配糖体 小肽 氨基酸 核苷酸

12 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 阳离子交换—— 阴离子交换—— UNOsphere S MacroPrep High S
分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 阳离子交换—— UNOsphere S MacroPrep High S MacroPrep CM Uno S 可以直接从中药的稀酸浸提液中捕捉生物碱 从黄连中分离盐酸小檗碱 从苦参中分离苦参碱、槐定 碱和氧化苦参碱 从虫草中分离虫草素 阴离子交换—— 可以直接从中药的稀碱浸提液中捕捉生物酸、皂甙、内酯、多酚、醇类等 从葛根中分离葛根素 从三七中分离三七素 从柴胡中分离柴胡皂甙 以及甘草酸、阿魏酸、咖啡酸、阿魏酸等的分离 UNOsphere Q MacroPrep High Q MacroPrep DEAE Uno Q

13 分离纯化策略—— 亲水性化合物 离子交换色谱 阳离子交换适合生物碱的纯化 粉防己碱 防己诺林碱

14 分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲水性分子排阻色谱 原理

15 分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲水性分子排阻色谱 按分子量大小分离 去除高分子量成分和聚合物 小分子较高分辨率分离
分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲水性分子排阻色谱 按分子量大小分离 去除高分子量成分和聚合物 小分子较高分辨率分离 快速分离中小分子有机酸、碱、皂甙、内酯、多酚、醇类等 , , ,000 Bio-Gel P2 Bio-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100 100 1,800 800 4,000 1,000 6,000 1,500 20,000 2,500 40,000 3,000 60,000 5,000 100,000

16 分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲和色谱——Affi-Gel硼胶 R OH
分离纯化策略—— 亲水性化合物 亲和色谱——Affi-Gel硼胶 R OH 对具有邻/顺式羟基的化合物具有高亲和力，可高效分离糖类，核苷酸，核苷，儿茶酚胺等化合物 R 配基结构 A、分离环GMP和GMP B、分离各种核苷、碱基 亲和机理

17 分离纯化策略—— 亲脂性化合物 亲脂性分子排阻色谱 硅胶反相色谱 高速逆流色谱

18 分离纯化策略—— 亲脂性化合物 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 原理

19 分离纯化策略—— 亲脂性化合物 Bio-Beads S-X介质—— 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体
分离纯化策略—— 亲脂性化合物 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 高分辨率，快速纯化酯类、芳香族，多环、杂环化合物 Bio-Beads S-X介质—— 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体 Bio-Beads S-X1 600 14,000 Bio-Beads S-X3 2,000 Bio-Beads S-X8 1,000 介质可兼容苯、甲苯、二甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮、二氯甲烷、二氯代苯、全氯乙烯等有机溶剂 Bio-Beads S-X12 400

20 分离纯化策略—— 亲脂性化合物 高分辨率亲脂性分子排阻色谱——Bio-Beads S-X介质 Bio-Beads S-X8分离效果
分离纯化策略—— 亲脂性化合物 高分辨率亲脂性分子排阻色谱——Bio-Beads S-X介质 Bio-Beads S-X8分离效果 1、三硬脂酸甘油酯，891 2、三肉豆蔻酸甘油酯，729 3、三月桂酸甘油酯，645 4、三辛酸甘油酯，477 5、三己酸甘油酯，393 6、十六烷，226 7、十一烷，156

21 分离纯化策略—— 亲脂性化合物 硅胶反相色谱 分辨率高，为分析首选 对样品要求较高 高反压，难装填，不适于放大
分离纯化策略—— 亲脂性化合物 硅胶反相色谱 分辨率高，为分析首选 对样品要求较高 高反压，难装填，不适于放大 C4：Hi-Pore RP 304 C18：Hi-Pore RP 318

22 分离纯化新技术—— 高速逆流色谱（HSCCC）
High Speed Countercurrent Chromatography 基于萃取原理的一种液液分配分离技术 使萃取过程在封闭的环境中进行 实现自动化过程 原理 高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。

23 分离纯化新技术—— 高速逆流色谱（HSCCC）
HSCCC DuoFlow

24 分离纯化新技术—— 高速逆流色谱（HSCCC）
应用：更适合亲脂性物质，手性分子等 条件： 螺旋速度 溶剂体系的选择 成功的案例 已从数十种常用中草药中分离纯化出高纯度的活性成分单体上百种，其中包括 银杏黄酮苷元异鼠李素和山柰酚、何首乌二苯乙烯苷、葛根素、紫杉醇及其多种类似物、三七苷和三七素、淫羊藿苷、白藜芦醇和白藜芦醇苷、丹参酮、苦参、生物碱、羌活醇、大黄蒽醌类衍生物、沙棘黄酮、强抗氧化物番素、茶叶中的单体儿茶素EGCG、ECG、GCG等等。 HSCCC分离茶多酚粗品 1、3、4为未知组分，2为EGCG（表棓儿茶素棓酸酯）

25 分离纯化策略—— 过程设计 亲水性化合物 亲脂性化合物 离子交换色谱与分子排阻色谱结合 亲和色谱与分子排阻色谱结合
分离纯化策略—— 过程设计 亲水性化合物 离子交换色谱与分子排阻色谱结合 亲和色谱与分子排阻色谱结合 亲脂性化合物 分子排阻色谱与高速逆流色谱结合 高速逆流色谱与反相色谱结合

26 硬件平台—— 中草药与天然产物研究平台 Bio-Plex 有效成分 DuoFlow＋HSCCC 各成分分离 BioPlex+Cytokine
各成分筛选 有效成分 Bio-Plex

27 谢谢！