氢化物发生--原子荧光法分析砷含量 山西省地方病防治研究所 程晓天.

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1 氢化物发生--原子荧光法分析砷含量 山西省地方病防治研究所 程晓天

2 氢化物发生--原子荧光分析（HG---AFS）是上世纪70年代才开始发展的分析技术，经过三十几年的发展，已成为成熟的高灵敏度的分析技术。特别是由于它在利用其他分析技术难以解决的砷、硒、铋等元素的分析中，灵敏度高，基体干扰少，操作简单，相对于发射光谱法，原子吸收法等具有明显的优势，受到了广大分析和研究人员的重视。我国仪器分析工作者，开发了实用性很强的高效低消耗的氢化物原子荧光分析仪器，达到并在很多方面超过了国际先进水平。由于仪器发展很快，标准方法的研制就相对滞后，旧的标准方法很快就不能适应新型仪器的应用。在地方性砷中毒的防治研究中，我们山西省地方病防治研究所比较早的应用了氢化物发生--原子荧光分析法测砷，作了一定量的工作，现在把我们的一些做法和经验教训与各位同行作一下交流，欢迎大家提出宝贵意见。

3 主要内容 一、生活饮用水中无机砷含量的测定--原子荧光法 二、氢化物发生--原子荧光法分析尿中砷 三、尿样消解带来的干扰问题
四、氢化物发生--原子荧光法分析过程中需注意的 问题 五、氢化物发生--原子荧光法与常规方法比较

4 一、 生活饮用水中无机砷 含量的测定--原子荧光法
一、 生活饮用水中无机砷 含量的测定--原子荧光法

5 1、原理 生活饮用水中无机砷以三价砷As（Ⅲ）和五价砷As（Ⅴ）两种价态存在，在酸性介质中，用硫脲和抗坏血酸使As（Ⅴ）还原为As（Ⅲ），即可进行测定。测定时，在原子荧光仪的氢化物发生系统中，酸与KBH4反应，产生大量新生态氢，新生态氢与As（Ⅲ）反应将As（Ⅲ）进一步还原为AsH3气体，由氩气将AsH3和新生的氢气载入石英炉原子化器，在原子化器中氢气燃烧使砷原子化。原子态的砷在特征波长的空心阴极灯照射下，产生电子跃迁，由基态变为激发态，当激发态的电子返回基态时即产生荧光，其荧光强度在一定范围内与样品中的砷含量呈正比，由此我们可以进行定量分析。

6 硫脲 AsO43- AsO33- 新生态氢 AsH3 抗坏血酸 原子化器 测定 空心阴极灯照射 As 产生荧光

7 KBH4+H++3H2O H3BO3+K++8H· AsO33-+6H· +3H+ AsH3 +3H2O 2AsH3 2As +3H2
氩氢火焰 原子化

8 反应块 测定 原子化器 AsH3 空心阴极灯 一级气液分离器 二级气液分离器 载气（氩气） 载流（盐酸） 还原剂（硼氢化钾）
(或样品待测液) 测定 原子化器 空心阴极灯

9 2、仪器 AFS系列原子荧光仪及配套分析软件

10 3、试剂 （本方法所用试剂如未特殊说明均为分析纯,水为去离子水 ）
■ 3.1 砷标准储备液（0.1mg/ml）：称取经105℃干燥2h的As2O3（优级纯）0.1320g于50 ml烧杯中，加入NaOH溶液（40g/L）10 ml溶解，加入浓盐酸10ml，转移到1000 ml容量瓶中定容，摇允。（此标准储备溶液可以由标准物中心购买）。 ■ 3.2 砷标准应用液（0.1µg/ml）：临用前将砷标准储备液逐级稀释。（如果为操作方便有时也可将该溶液继续稀释为更低浓度。） ■ 3.3 硫脲（5%）---抗坏血酸（5%）溶液： 称取5g硫脲和5g抗坏血酸，溶于100ml水中（临用前配）。

11 ■ 3.5 5%(v/v)盐酸（载流）：取50ml浓盐酸（优级纯以上）溶于1000ml水中。
■ 3.4 KBH4(2%)—NaOH(0.5%) (还原剂)溶液： 称取 2.5gNaOH和10gKBH4溶于500ml水中（此溶液于4℃冰箱可保存一周）。 ■ %(v/v)盐酸（载流）：取50ml浓盐酸（优级纯以上）溶于1000ml水中。 ■ 3.6 盐酸（1+1）： 浓盐酸（优级纯以上）与水等体积混合。 ■ 3.7 氩气（载气）：纯度大于99.99%

12 4、分析步骤与计算 4.1标准系列制备：在容量瓶或比色管中加入砷标准应用液、盐酸（1+1）、硫脲（5%）--抗坏血酸（5%）溶液和去离子水，配制含砷分别为0，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0µg/L，含盐酸5%(v/v) ，含硫脲、抗坏血酸各1%的标准系列，0 µg/L的溶液为试剂空白，需配制100ml（用容量瓶），其余几个标准点可配制10ml（或5ml）（用10ml刻度管）。混匀，放置20--30分钟，待测。如样品浓度过高可将标准系列向高浓度方向延伸，也可以用仪器的稀释重测功能。（如样品含量过高，标准系列的最高点可以延长至砷含量为32.0µg/L，但不能太高，因为虽然原子荧光法线性范围宽，但毕竟是微量分析，浓度太高对仪器系统和低浓度样品的分析都会产生影响，而且曲线会发生弯曲。）

13 4. 2 样品处理：取水样0. 5—3. 5 ml于10 ml比色管中（如果样品含量过高还需将样品稀释后再取样。），加入盐酸(1+1)0
4.2 样品处理：取水样0.5—3.5 ml于10 ml比色管中（如果样品含量过高还需将样品稀释后再取样。），加入盐酸(1+1)0.5 ml，硫脲（5%）---抗坏血酸（5%）溶液1 ml，加水至5 ml，充分混允，放置20-30分钟（如室温较低需放置30分钟），待测。

14 4.3测定：以盐酸（5%）(v/v)为载流，KBH4(2%)—NaOH(0.5%)溶液为还原剂，氩气为载气，开机测定。
4.3.1仪器参考条件：灯电流：60mA; 光电倍增管负高压：270mv；原子化器高度：80；载气流量：400ml/min；屏蔽气流量：1000ml/min；进样体积：0.5ml。（一般情况下，仪器的默认条件都很好，不需改变，只有在仪器性能或灯不太好是才需改变测试条件。） 4.3.2开机：输入相应的文件名，选择仪器条件，提供相应的参数，如：标准系列浓度、样品稀释倍数、结果浓度单位、测定重复次数等。 4.3.3测定步骤：测定之前，仪器运行20分钟预热，根据仪器提供的分析软件测定，先测试剂空白和标准系列，最后测定样品。 4.3.4计算：测定完毕，由仪器自动计算样品含量并打印结果。

15 配制KBH4要先将NaOH溶于水再加KBH4,否则KBH4一旦溶于水就会有氢气产生造成损失。
5、说明： 本方法的线性范围为 µg/L，在此范围内相关系数大于0.9995，最低检测浓度为0.06µg/L.如果取3 ml样品，最低检出限为0.1µg/L。 6、注意： 配制KBH4要先将NaOH溶于水再加KBH4,否则KBH4一旦溶于水就会有氢气产生造成损失。

16 二、氢化物发生--原子荧光法 分析尿中砷

17 1、 原理 尿样中的砷经湿法消解后，以五价砷的形式存在，加入盐酸和硫脲-抗坏血酸溶液，将五价砷还原为三价砷。在HG---AFS测定过程中，硼氢化钾和盐酸反应生成的新生态氢，三价砷与新生态氢反应生成砷的共价化合物砷化氢气体，由氩气载入HG---AFS仪器的原子化器中，分解成原子态砷，在编码空心阴极灯的发射光激发下产生原子荧光，其荧光强度在固定条件下与被测液中的砷浓度成正比，与标准系列比较可以达到定量分析的目的。

18 2、仪器与试剂 2.1仪器 AFS系列原子荧光光度计及配套分析软件；自控电热消解仪及配套特制具有刻度和磨口塞的消解管。 2.2氩气
纯度大于99.99%

19 2.3试剂 2.3.1 HNO3（1+1）：浓硝酸（超纯）与水等体积混合。 2.3.2 H2O2（30%）（超纯）。
（本方法所用试剂如未特殊说明均为分析纯，水为去离子水） HNO3（1+1）：浓硝酸（超纯）与水等体积混合。 H2O2（30%）（超纯）。 硫脲（5%）---抗坏血酸（5%）溶液： 称取5g硫脲和5g抗坏血酸，溶于100ml水中（临用前配）。 KBH4(2%)—NaOH(0.5%) (还原剂)溶液： 称取 2.5gNaOH和10gKBH4溶于500ml水中（此溶液于4℃冰箱可保存一周）。 %(v/v)盐酸：取50ml浓盐酸（优级纯以上）溶于1000ml水中。 盐酸（1+1）： 浓盐酸（优级纯以上）与水等体积混合。 砷标准储备液（1mg/ml）：称取经105℃干燥2h的As2O3（优级纯）0.6602g溶于5 ml NaOH溶液（200g/L）中，用酚酞作指示剂，以1mol/L硫酸溶液中和至中性，再加入15ml 1mol/L硫酸，转移到500 ml容量瓶中定容，摇允。（此标准储备溶液可以由标准物中心购买）。 砷标准应用液（0.1µg/ml）： 临用前将储备液逐级稀释。

20 3、分析步骤 3.1采样 样品采集于经分析实验室常规处理干净的塑料瓶中，冰箱冷冻（-20℃）或冷藏（4℃）保存,分析前融化摇匀。
3.1采样 样品采集于经分析实验室常规处理干净的塑料瓶中，冰箱冷冻（-20℃）或冷藏（4℃）保存,分析前融化摇匀。 3.2 尿样处理 取1ml尿样于消解管中，加入0.25ml硝酸（1+1），0.5ml过氧化氢。同时做3个以上样品空白。放置过夜，次日于消解仪上缓慢加热至120℃，恒温大约30分钟，再升温至150℃，消解至无色透明，然后加热至180℃蒸发赶酸至湿盐状态（溶液体积应小于0.2 ml）。如有个别样品在接近0.5ml时仍能看到颜色，可补加少量过氧化氢，使有机物完全破坏，并继续消解至湿盐状态。稍冷，加入1ml水，再蒸发至湿盐状态。稍冷，加入1ml 盐酸(1+1)，再加热大约1分钟，消解赶酸完毕。冷却后加入5ml水、2ml硫脲抗坏血酸溶液，再加水至10ml定容，混匀，放置20--30分钟，待测。此待测体系中含有盐酸5%(v/v)、硫脲、抗坏血酸各1%。

21 3. 3 标准系列制备：在容量瓶或比色管中加入砷标准应用液、盐酸（1+1）、硫脲（5%）---抗坏血酸（5%）溶液和去离子水，配制含砷0，1
3.3 标准系列制备：在容量瓶或比色管中加入砷标准应用液、盐酸（1+1）、硫脲（5%）---抗坏血酸（5%）溶液和去离子水，配制含砷0，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0µg/L，含盐酸5% (v/v) ，含硫脲、抗坏血酸各1%的标准系列，0 µg/L的溶液为试剂空白，需配制100ml（用容量瓶），其余几个标准点可配制10ml（用10ml刻度管）。混匀，放置20--30分钟，待测。如样品浓度过高可将标准系列向高浓度方向延伸，也可以用仪器的稀释重测功能。（如样品含量过高，标准系列的最高点可以延长至砷含量为32.0µg/L，但不能太高，因为虽然原子荧光法线性范围宽，但毕竟是微量分析，浓度太高对仪器系统和低浓度样品的分析都会产生影响，而且曲线会产生弯曲。）

22 3.4 测定：以盐酸（5%）(v/v)为载流， KBH4(2%)—NaOH(0.5%)为还原剂，氩气为载气，开机测定。
3.4.1 仪器参考条件：灯电流：60mA; 光电倍增管负高压：270mv；原子化器高度：80；载气流量：400ml/min；屏蔽气流量：1000ml/min；进样体积：0.5ml。 3.4.2开机：输入相应的文件名，选择仪器条件，提供相应的参数，如：标准系列浓度、样品稀释倍数、结果浓度单位、测定重复次数等。 3.4.3 测定步骤：测定之前，仪器运行20分钟预热，根据仪器提供的分析软件测定，先测试剂空白和标准系列，最后测定样品。测定完毕，仪器自动计算并打印结果。

23 4、说明 4.1 线性范围和相关系数：本方法的线性范围为 0---200µg/L，在此范围内相关系数大于0.9995。
4.2 检出限：如果取1ml样品，则本方法的最低检出限为0.6µg/L。 4.3 注意：配制KBH4要先将NaOH溶于水再加KBH4,否则KBH4一旦溶于水就会有氢气产生造成损失。

24 本方法灵敏度高，取样量少，线性范围宽，准确可靠，操作简单，节约了试剂和时间，选用以毒性较低且容易赶尽的过氧化氢为主消解尿样，消解过程产生的有毒气体少，减少了污染，有利于操作者健康。从2003年就开始在地方性砷中毒的防治研究的各项课题中进行应用，其结果与临床检查、水砷含量有很好的一致性。最近，我们按照生物样品标准方法研制指南的要求进行了验证，灵敏度、精密度、准确度等指标都很好，结果满意。

25 三、尿样消解带来的干扰问题

26 水样分析中基体干扰很小，但尿样的分析由于需要消解，所带来得基体干扰必须引起注意。我们所做的就是在能够保证完全消解的基础上尽量少加硝酸等消解试剂（由于氢化物发生--原子荧光法：灵敏度高，使得少取样、少加消解试剂成为了可能），而在消解完成后尽量赶尽消解试剂。

27 我们最初预试方法时，发现样品空白低于试剂空白。如果试剂含砷，应该是正干扰，这种负干扰应该是试剂残留造成的，为了搞清干扰原因， 我们用标准曲线2µg/L的点，模拟干扰过程，在标准待测液中加入可能存在的残留。结果发现在尿样消解过程中有可能带来如下基体干扰：

28 1、过氧化氢残留：如果存在过氧化氢残留可能带来负干扰。随着待测标准液中加入过氧化氢量的增加，负干扰越大。而且配置好的待测液，在几十分钟后会产生沉淀。随着加入过氧化氢量的增加，出现有这样的现象：即少量沉淀—沉淀增多—沉淀消失。这种沉淀可能是过氧化氢氧化硫脲、抗坏血酸的中间产物。 2、硝酸根残留：硝酸根的存在基本不影响测定，但随着待测标准液中加入硝酸量的增加，会增大待测体系酸度，使荧光值增大，产生正干扰。这种由酸度带来的正干扰应该是很小的，因为我们用的硝酸量很小，而且绝大部分被消耗掉了。 3、亚硝酸根残留：如果存在亚硝酸根残留可能带来负干扰。在待测标准液中加入亚硝酸根，产生的负干扰和过氧化氢是相似的，而且也会产生沉淀。消解过程中一定会产生亚硝酸根，要注意这种负干扰的产生。

29 分析过程中可能还有其他氮氧化物物质残留，我们没有再详细研究，这里也没有考虑试剂含砷带来的正干扰，因为我们用的试剂纯度很高。 但通过少加和尽量赶尽的方法，再多做几个样品空白，基本能克服这些基体干扰，我们的验证工作可以说明这一点。硝酸残留的影响，有许多报道，结果不一致，这里只是在我们的分析条件下作的结果。

30 四、氢化物发生--原子荧光法 分析过程中需注意的问题

31 1、防止污染： 玻璃或塑料器皿一定要洗干净，用过后马上洗，长时间接触高砷的器皿很容易被污染。而且有些玻璃器皿本身含砷，特别是做试剂空白的容量瓶，一定要注意有无砷污染。用耐酸碱的塑料管要好一些。 2、试剂纯度要高： 试剂中长含微量砷（如盐酸、过氧化氢、高氯酸等），硼氢化钾纯度要高分析用去离子水质量要高。

32 3、待测溶液酸度要与载流相一致。 4、样品空白很重要，需多做几个。 5、测定过程要带标样，防治数据漂移。 6、标准系列浓度不可太高，对仪器系统 和低浓度样品的分析都会产生影响， 而且曲线会发生弯曲。

33 五、氢化物发生--原子荧光法 与常规方法比较
五、氢化物发生--原子荧光法 与常规方法比较

34 砷的测定方法很多，比较常用、而且已成为国标法的有银盐法（DDCAg法）、新银盐法、砷斑法、 氢化物发生原子吸收法(HG-AAS法)、氢化物发生--原子荧光法等。

35 1、砷斑法：半定量法，操作简单，实用性强，只能用于水样的大面积筛查。（近几年我们使用的半定量试剂盒就是这种方法。）
2、银盐法（新银盐法）：分光光度法，仪器价格较低，但灵敏度低、取样量大、操作复杂、容易带来分析误差，而且所用试剂成本高。 3、氢化物发生原子吸收法：光路复杂、光源不如原子氢化物发生---原子荧光法，气相干扰较氢化物发生---原子荧光法大，检出限、线性范围等均不如氢化物发生---原子荧光法。 4、氢化物发生---原子荧光法：光源好、灵敏度高、基体干扰少、线性范围宽、自动化程度高、操作简单，质量可靠，应用软件也比较成熟。

36 结 语 氢化物发生---原子荧光法：灵敏度高、基体干扰少、线性范围宽、操作简单，而且国产原子荧光分析仪器价格适中，质量可靠，可以在地方性砷中毒的防治研究中大大提高分析质量和分析效率，节约分析成本。

37 谢谢！