第二章 医学电子显微学研究方法 第一节 TEM样品制备技术

Presentation on theme: "第二章 医学电子显微学研究方法 第一节 TEM样品制备技术"— Presentation transcript:

1 第二章 医学电子显微学研究方法 第一节 TEM样品制备技术
第二章 医学电子显微学研究方法 第一节 TEM样品制备技术 细胞是生物体结构和功能单位，细胞小结构复杂无色透明，若不借助适当的手段，难以观察，更难发现细胞内各种成份的分子组成和功能，因此研究细胞的技术决定了我们对细胞的认识。许多细胞生物学的重要进展及新概念的形成来自新技术的应用。 在实际应用中电镜图像的分辨率，不仅取决于电镜本身的分辨率,也取决于样品的结构和反差，而样品的结构和反差在很大程度上受到样品制备技术的限制。电镜的分辨率在1.24Å ，生物样品最佳制备仅能达到20－30Å ，这样远远不能发挥电镜的高分辨性能，这种差距说明许多更小的结构细节还没有被人们发现和认识。

2 超薄切片技术 Ultrathin Section Techniques 是TEM生物样品制备中最基本的常规技术。它是通过一系列化学方法把组织和细胞制备成树脂包埋块，这种包埋块应具备以下性能：
1、最大限度的保持组织和细胞在生活状态下的结构及形态，保存抗原和酶的活性。 2、切片厚度在50－100nm，具有固定的形状。 3、透光度好，耐电子束轰击。 4、在TEM下树脂不成像，经过电子染色切片具有良好的反差 超薄切片技术是1948年 Pease 和 Barker 二位英国科学家创立的，经过多年的不断发展和改进现已趋于完善。现将样品制备程序归结如下：

3 超 薄 切 片 制 备 程 序 Preparetion procecture of ultrathin section
取材 细切 预固定 冲洗 后固定 冲洗 脱 水 浸透 包埋 聚合 包埋块 修整 半薄切片 复红和次甲基蓝染色 光 镜定位 超薄切片 电子染色 TEM观察 一、取材 Materail 从动植物机体上，细胞及微生物的培养物中，取得所需材料的过程叫取材。由于生物材料在离开机体或正常的生长环境后，其结构在自溶酶的作用下，容易发生死后变化。为了保持生物材料的原生活状态，取材时应遵守以下原则

4 1、取材的要求 ⑴ 准确：根据研究的目的和要求，要准确的确定取材的位置⑵ 快速：为了保持生物材料的活体状态，取材速度要块，最好在1－2分钟之内，将所取样品放入固定液中。 ⑶ 样品体积要小：由于固定液的渗透能力弱，四氧化锇的渗透深度为0.25mm，戊二醛的渗透深度为0.5mm。为了保证固定剂能均匀的渗入到样品内，一般要求样品体积不超过2mm³。 ⑷ 低温取材：细胞离体后，细胞内的各种水解酶释放到组织中使构成组织的主要结构，蛋白质、核酸降解造成自溶，为了降低酶的活性，要在0-4℃低温条件下取材保存。

5 样 品 取 材 示 意 图

6 ⑸ 防止损伤：取材前要作好准备工作，用铅笔写好标签。取材器具要锋利，动作轻巧，防止挤压造成细胞的损伤。
2、取材的方法 材料来源于，实验动物、手术样品、血液、骨组织、培养细胞和活检材料等。 ⑴ 实验动物材料：将动物用乙醚麻醉后处死，取出所需材料切成长条状，粗细在1.0×1.0×3.0mm³放入固定液中固定30分钟，然后细切成1－2mm³的小块继续固定2小时。4℃存放。 ⑵ 人体组织材料：包括病理活检和尸检材料，这种组织往往带有血液和组织液成份，取材时用生理盐水反复冲洗后再固定。尸检材料一般在低温下保存的组织，争取在死后3－12小时内取材，最长不超过24小时，否则造成细胞膜结构的损伤。

7 ⑶ 体外培养细胞材料：对生长在培养瓶中的细胞，去掉培养液，放入适量的固定液固定3－5分钟后用刮刀刮下贴壁细胞离心，离心1500－3000转15分钟，使细胞沉淀聚团。
⑷ 血液材料：取外周血3－5ml，放入加有抗凝剂的试管内，1ml血加抗凝剂0.15ml，离心沉淀1500转15分钟至分层。血清－血小板－白细胞－红细胞，根据所需材料，取不同的分层液，然后加入新鲜的戊二醛离心固定。 抗凝剂的配制 柠檬酸纳 g 柠檬酸 g 葡萄糖 g 双蒸水加至 ml

8 ⑸、骨组织材料：骨组织比较坚硬，取材时组织块尽可能小一些，放入固定液中固定后在放入脱钙剂中，根据不同部位的骨组织，采用不同的脱钙时间。一般脱钙时间为1－3周，每周更换一次脱钙剂，待骨组织能被针刺进，即为钙盐已经脱好，可以进行常规制样。 脱钙剂的配制 （PH7.2) EDTA g 0.2M磷酸缓冲液 ml 蔗糖 g 双蒸水加至 ml ⑹ 需要定向取材的组织：例如，胃、肠、血管、气管、食道和分层的组织，皮肤、角膜、子宫等在取材时需定位切剪成条状，大小在 1.0×1.0×3.0mm³, 定位包埋。

9 二、固定 Fixation 用化学和物理的方法快速杀死细胞的过程叫作固定。 1、固定目的 在分子水平上把细胞可动的动态系统，转变成不可动的，稳定的胶体，而且这种胶体接近于生活时的状态，使细胞的微细结构完好无损。 2、固定剂的作用 ⑴ 能快速均匀进入细胞内，稳定细胞内各种化学成份。提供细胞骨架作用。 ⑵ 能快速杀死细胞，与细胞内的大分子物质、蛋白质发生化学结合形成交连， 使蛋白成份凝固，保存糖类和脂肪生 活时的状态和位置。 ⑶ 避免有机溶剂对脂类物质的抽提，对细胞不产生收缩和膨胀作用，不产生人工假象和变形。 ⑷ 保存酶的活性和抗原性。

10 3、固定剂的种类和特点 理想固定剂不但能完整的保存细胞微细结构，同时还具有良好的电子反差，固定剂主要作用于蛋白质、脂肪和糖类。作用原理尚不清楚，至今还没有一种全能的固定剂对物质很好固定，各种固定剂对细胞成份的固定是有选择性的。电镜生物样品采用双重固定法。常用固定剂有以下几种： ⑴、戊二醛 gluteraldehyde 戊二醛是一种五碳醛，含有二个醛基，对细胞微细结构有很强的亲和力，其结构式为 O＝CH－CH2－CH2－CH2－CH＝O，分子式为 C5H8O2。市售浓度为25%－50%水溶液，PH 。高温、中性或碱性PH均能使戊二醛发生聚合失去醛基，降低高联效力。电镜生物样品常用戊二醛的浓度为2.5-3%，4℃保存备用。

11 优点 A：和组织细胞反应迅速，渗透深度大0.5mm。
B：对蛋白质、糖原有较好的固定效果。 C：对细胞内膜性结构保存良好，例如：微管、ER、 Mit膜和细胞基质。 D：能较好的固定植物组织。 缺点 A：没有电子染色作用。单独用戊二醛固定的生物样 品电子反差不好，不能显示膜结构。 B：对脂肪保存效果不好。 戊二醛配制 %戊二醛磷酸固定液（PH7.4） 0.1M磷酸缓冲液 ml 25%戊二醛 ml 双蒸水加至 ml

12 ⑵、四氧化锇 Osmiam tetroxide
四氧化锇俗称锇酸（OSO4），是一种淡黄色、具有强烈刺激气味的晶体，为强氧化剂与氮原子有很强的亲和力。常用浓度为1%，4℃保存。 优点 A：对蛋白质、氨基酸有非常好的固定作用，是唯一能 保存脂类的固定剂。 B：对样品有很强的电子染色作用，提高图象的反差。 缺点 A：对糖类、核酸保存作用差穿透能力弱， 反应缓慢。 不保存抗原和酶的活性，不能用于细胞化学。 B：剧毒，蒸发的气体对粘膜组织有损伤。 四氧化锇的配制 %四氧化锇固定液 1%四氧化锇 g 0.1M磷酸缓冲液 ml

13 4、常用的固定方法 ⑴单固定法：对单个细胞，固定液易于渗透的组织，一般用1%四氧化锇固定1－2小时即可。 ⑵双重固定法：用戊二醛预固定2小时，样呈淡黄色，然后在用1%四氧化锇后固定1小时，样品呈黑色。戊二醛和四氧化锇之间可以产生沉淀反应，所以要充分洗涤。 ⑶原位固定法：此法用于解剖关系复杂和对缺氧比较敏感的组织，在保持器官血液供应的情况下，边解剖边将固定液滴加到器官上使组变硬后在取材固定。 ⑷灌流固定法：用于脑垂体、甲状腺、甲状旁腺等血液供应丰富的组织，通过血液循环的途径，将固定液灌注到组织中，待组织硬化后取材作双重固定。

14 三、脱水 Dehydration 用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水分。因为水的存在会使组织细胞的结构在电镜高真空状态下急聚收缩而破坏。常用的包埋剂是非水溶性的，细胞中游离水影响包埋剂的浸透，造成切片和观察的困难。常用的脱水剂为丙酮，为了防止样品的剧烈收缩，脱水采用梯度脱水法。 乙醇和丙酮 时间 温度 50 % 分钟 ℃ 70 % 分钟 ℃ 90 % 分钟 ℃ 100 % 次每次10分钟 室温 注意事项：脱水要彻底，时间和速度要适当。一般认为脱水剂在70 % 时是组织变化最小的状态，可以延长时间。

15 四、浸透 Penetration 经过脱水处理的样品，需要用包埋剂浸透，其目的是用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞的内外空隙都被包埋剂充填。浸透时间最好为9－12小时，一般过夜后进行包埋。 五、包埋和聚合 Embeding and Polymeriztion 包埋是指样品内的脱水剂被包埋剂完全置换后将样品和包埋剂放入药用胶囊内，在热作用下聚合成固体包埋块的过程。 ⑴、包埋剂的种类和配制 良好的包埋剂具有易溶于脱水剂，粘稠度低、聚合均匀、耐电子束轰击、能良好的保存微细结构、高倍放大下不显示自身结构。目前常用的包埋剂有二种 环氧树脂618：国产，为淡黄色粘稠度较大的液体，对组织损 伤较小，对细胞的微细结构尤其是膜结构保存 完好。粘稠度大，对组织浸透不均匀。

16 Epon812：进口，是国际上普遍使用的一种优良的包埋剂，为
淡黄色粘稠度低的树脂，渗入组织快均匀，价格 昂贵。 环氧树脂618配方 Epon812配方 环氧树脂 ml Epon ml DDSA(硬化剂） 5.0ML DDSA ml 十二烷基琥铂酸酐 DBP (增塑剂〕 0.3ml MNA ml 邻苯二甲酸二丁酯 DMP (催化剂） 0.5ml DMP ml 二甲氨基甲基

17 ⑵ 包埋方法 常规包埋法：把组织放入药用胶囊的顶端，放入实验标签，然 后加入包埋剂。 定向包埋法：根据材料的不同，定向取材及包埋。 包埋注意事项: 在包埋的过程中，避免水蒸气的进入，必须在 干燥的环境下工作。 各 种 包 埋 模 具

18 ⑶ 聚合 聚合方法：将放有组织块和树脂的胶囊，放入包埋模具中，烤 箱内聚合48小时。 温度 时间 37℃ 小时 45℃ 小时 60℃ 小时 聚合的原理： 环氧树脂为热塑性树脂，它和一定的硬化剂、催化剂在温度的作用下形成不可塑性黄色透明固体块，称为包埋块。DDSA在树脂聚合中起到固化剂的作用，DMP－30加速了树脂的聚合，为了改善包埋块的切割性DBP起到了增塑的作用。

19 六、包埋块的修整 将聚合好的包埋块，用70℃热水洗去胶囊，用修块机把组织修成45℃角立体梯形。 包 埋 块 的 修 整

20 七、半薄切片 对于某些必须限定方向或部位的结构，如肌纤维的断面、脑内的核团、病变的区域等，在进行超薄切片前，需先进行半薄切片（1um)的厚片在光镜下定位，才可以比较准确的选择超薄切片的部位，避免盲目切片，提高电镜的观察效率。 半薄切片染色法： 次甲基蓝天青Ⅱ－碱性复红染色：细胞核、胶原和结缔组织为蓝色，线粒体、髓鞘、细胞浆、平滑肌为红色。

21 八、铜网和支持膜 coppergrid and support film
TEM用金属载网和支持膜来支撑超薄切片的样品，常用的金属载网有铜网和镍网，直径在2－3mm,网格为200目为宜。 大孔载网，电子束透过率高，支持性差，适用于低倍大视野观察，小孔载网，电子束透过率低，支持性好，适用于高倍高分辨观察。镍网适用于免疫电镜。 铜网的类型 ： 1－3 150目；4－6 180目；7 200目；8.9 单孔； 10－12多缝。

22 支持膜，由于生物样品对电子束轰击的耐受力较弱，所以要在铜网上覆盖一层支持膜。支持膜本身没有结构，薄而透明易被电子束穿透，有很强的机械强度，耐电子束轰击，不和样品发生化学反应。厚度在150Ǻ。
1 formvar：化学名称是聚乙烯醇缩甲基，机械强度高。 2 火棉胶膜：机械强度弱，制作简单。 3 碳膜：机械性和化学性稳定性好，适合高分辨电镜用。

23 Formvar 膜 的 制 备 方 法 1、载玻片浸入Formvar溶液中 2、在水面上剥离Formvar膜 3、将载网置于Formvar膜上

24 九、超薄切片 Ultrathin Section
超薄切片是以厚度为单位进行的切片，制备超薄切片的机器为超薄切片机，根据其工作原理分为热膨胀式和机械推进式二种。切片的环境温度在18－25℃，湿度在60%以下，室内要安静。切片厚度在500Ǻ。 切片质量的判定： ⑴ 厚度：暗灰色为400Ǻ以下；灰色为400－500Ǻ；银白色 为500－700Ǻ；金黄色为700－900Ǻ；紫色900Ǻ以 上，以灰色为宜。 ⑵ 切片无刀痕，无皱褶，无污染。

25 SUPER NOVA 超 薄 切 片 机

26 十、电子染色 positive staining
⑴ 电子染色的概念：电子染色又称阳性染色，与光镜组织标本染色概念完全不同，它不是有以颜色来分辨组织结构的，而是用重金属盐和细胞内的某些成份结合或吸附，在电子束的照射下，样品形成不同的散射能力，而提高图像的反差，以达到染色的目的。 ⑵ 电子染色的原理：细胞和重金属盐结合，细胞不同结构吸附重金属原子数量的能力不同，结合较多的区域具有大的电子散射能力，在电镜下电子反差强，结合少的或没有结合的区域电镜下为透明区。通过电子染色提高图像的反差。 ⑶ 染色剂 醋酸双氧铀：显示蛋白质、核酸和胶原纤维。缺 点，具有放 射性和化学毒性。染色30分钟。35℃ 枸橼酸铅： 对膜结构和脂肪染色好。缺点容易和空气中的二 氧化碳结合产生碳酸铅，污染样品。染色30分钟

27 第二节、SEM生物样品制备技术 SEM适用于生物样品表面及其断面的微细结构观察。生物样品具有含水量大、质地柔软、干燥脱水易变形、机械强度低，不能耐受电子束轰击、多数生物组织是由原子序数较低的元素组成，具有二次电子发生率低的特点。样品制备时需遵守以下原则。 1、SEM生物样品制备的基本要求 ⑴、每一处理过程都应防止样品的污染和损伤，保持样品原有的形貌和微细结构。 ⑵、去除样品内的水分，干燥过程中尽量减少样品体积的变化和人工损伤。 ⑶、增强样品的导电性，提高二次电子发射率。 ⑷、注意保护样品的观察面。

28 2、SEM样品的制备方法 ⑴ 常规制备法 取材 清洗 固定 脱水 干燥 镀膜 SEM观察 ⑵ 内部结构剖出法 取材 1%OsO4固定 DMSO固化割断 0.1%OsO4 软化基质，突出膜性结构 1%OsO4后固定固割断面 2%单宁酸组织导电处理 脱水 干燥镀膜 SEM观察。 ⑶ 单宁酸－四氧化锇组织导电法 样品灌流固定 2%单宁酸＋ 2%戊二醛混合液 30分钟（表面样品）8小时（内部结构）导电处理 M磷酸缓冲液清洗 2%OsO4后固定 脱水干燥 镀膜 SEM观察。

29 3、SEM生物样品制备程序 ⑴ 取材 A：取材前应制备好药品和器具。 B：取材样品要新鲜，标记好样品的观察面。 C：取材部位准确，大小在3X5mm³左右，数量要少。 ⑵ 清洗 SEM观察，对样品表面的清洗十分严格，覆盖在样品表面的血液、组织液、粘液必须清洗干净，防止对微细结构的掩盖。在制样过程中共有三次清洗，第一次用清洗液洗掉样品表面的杂质，第二、三次是除掉没有和样品成份发生反应的固定液。根据样品的性质选择不同的清洗液。 A：对样品表面的血液和组织液，用生理盐水和缓冲液冲洗。 B：对空腔器官表面的粘液，用不同浓度的蛋白水解酶处理。 C：对一些特殊的组织，用特殊方法清洗。例如，内耳螺旋器的 胶质膜，盐酸浸泡。乳腺组织用乙醇和甘油处理。

30 ⑶ 固定 与TEM一样，为了把生物样品的微细结构和外貌真实的保留下来，样品必须进行固定处理。通过固定使组织硬化，提高样品在干燥过程中的耐受表面张力和电子束轰击。常用方法为戊二醛和四氧化锇双重固定法。 ⑷ 脱水 SEM样品体积大，脱水可以防止样品在高真空下变形，脱水剂为乙醇，采用梯度脱水法，用乙醇逐步取代样品中的水份。在脱水过程中应防止样品暴露在空气中，发生干燥变形等。 ⑸ 干燥 A 干燥的目的：样品经脱水后水份被脱水剂取代，样品内含有脱水剂和少量残存的水分，特别是样品表面的脱水剂和残留水分所形成的表面张力，使样品表面结构严重破坏。干燥的目的是去除样品内残留的水分和脱水剂，保存样品的表面形貌。

31 B 干燥方法： b1 空气干燥法 ：这是一种最简便最原始的干燥法，将经过常规固定的样品，放入低表面张力的液体内（丙酮、乙醇、乙醚等），采用梯度法置换出样品内的水分，然后再把样品放在空气中，使其样品所含的溶剂自然挥发，而达到干燥的目的。此法只适用于比较坚硬或具有鳞片及含水分较少的生物样品。 b2 叔丁醇干燥法 ：叔丁醇是一种有机溶剂，它的溶点为25.5℃，经脱水后的样品，置于100％叔丁醇内经冷冻降温至10℃左右变为固态，在真空镀膜机内，使固态的叔丁醇逐渐升华变成气态，以达到干燥的目的。 b3 CO2临界点干燥法 ：这是目前认为最可靠而理想的样品干燥法。CO2临界点干燥是利用液体二氧化碳在临界状态下液相消失而没有表面张力的特点，使生物标本达到干燥的目的。

32 临界点干燥的原理： 根据物质存在着临界状态的特性，用HCP－2型临界点干燥器进行样品干燥。在温度和压力的变动下，物质所存在的固态、液态和气态这三种形式可以相互转化，当温度和压力升到一定数值时，气体的密度增大与液体一样，此时气相和液相的界面消失，液体表面张力消失。物理学中将这种情况称为临界状态，此时的温度和压力分别为临界温度及临界压力。临界点干燥就是利于物质在临界状态下，液体表面张力被消除的特性，克服样品干燥过程中的变形，保持样品原貌。 临界点干燥的步骤和中间剂 临界点干燥处理包括两次置换和临界状态下干燥三步。第一步用中间剂醋酸异物酯置换脱水剂，第二步用干燥剂置换脱水剂，第三步是临界状态下干燥，使干燥剂进入临界状态，从而达到样品的干燥。

33 ⑹ 样品的粘胶 干燥处理后的样品，需用SEM专用导电胶粘贴在金属样品座上。 目的：保证样品在样品台上不移动，防止脱落，尤其在倾斜 和旋转时。导电胶可以增强样品与样品台之间的导电 性，使样品上聚集的电子能通过导电胶传递到样品台 上。 方法：①样品的大小和形状不同，宜采用相应的粘贴方式， 不能因涂胶过多而掩盖要观察的结构。 ②粘贴样品前，要确实认准观察面，保证观察面向上。 ③经脱水和干燥处理后的样品，脆而易碎，粘贴时动 作要轻柔，防止反复夹持样品。 ④样品粘贴后，要待导电胶干透后再进行金属镀膜。

34 ⑺ 样品的导电处理 生物样品电阻很大，导电性也很差，当接受电子束照射时，会在样品表面形成电子的堆积，称为放电效应，因而影响SEM的观察。为能得到理想的图像，必须对样品进行导电处理。常用的导电方法有 离子镀膜法：Ion coating 又称离子溅射，是增强生物样品导电性能比较理想的方法。其工作原理，在该机真空罩的顶部和底部分别装有阴极和阳极，阴极的内表面有一金属靶，样品放在阳极上，当罩内真空度达到1×10¯ ²托低真空时，在 两极间加以1000～3000V的直流电压。在电场的作用下，使罩内残留的气体分子被电离为阳离子和电子，它们分别飞向阳极和阴极，同时阳离子又可轰击阴极上的金属靶，使部分金属原子被溅射出来，这些金属原子在电场的加速作用和气体分子的碰击下，以不同的方向和角度飞向阳极，并呈漫散射的方式覆盖在样品的表面，形成一层连续而均匀的金属膜。

35 IB－3 型 离 子 镀 膜 仪 原 理

36 离子镀膜的技术要求 ① 样品在离子镀膜前，必须进行严格的脱水和干燥处理，若样品干燥不充分，金属离子不仅不能很好的附着，反而会损伤样品，特别是放出的有机气体，会因为受电离而分解，给样品带来“黑化污染”。 ② 镀膜时，样品要放在金属靶的正下方不能超过阳极板面积的80％， 样品数目虽不限，但其总面积要控制在靶面积的三分之一以内。离子溅射速度与样品到靶极的距离成反比，距离大溅射的速度慢，当两极间的电压与样品到靶极的距离不变时，可通过对溅射时间的控制来掌握镀膜的厚度。

37 组织导电技术 Tissue conduction techniques
是利用金属盐类、特别是重金属盐类化合物，与生物组织内蛋白质、脂类和淀粉起化学结合作用，以达到样品表面离子化，增强导电性及耐电子束轰击的能力。如将组织导电技术和金属镀膜结合使用，将会制出更为理想的高分辨生物样品。常用的组织导电法为单宁酸－锇酸法。

38