王文玲 中国疾病预防控制中心病毒病所 应急技术中心 2015年6月9日

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1 王文玲 中国疾病预防控制中心病毒病所 应急技术中心 2015年6月9日
中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测 王文玲 中国疾病预防控制中心病毒病所 应急技术中心 2015年6月9日

2 中东地区涵盖了西亚的大部分国家和埃及，含18个有着多种宗教信仰群体的国家。它是世界上最繁忙的政治和经济中心之一，有许多独特的宗教和文化习俗，比如每年的麦加朝圣，与之相伴的是食物、药品、商贸活动和城乡间的交往都依赖于骆驼。这种显著的地域特征为新型变异迅速的病毒的产生提供了有力条件。

3 参考标准 中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）实验室检测技术 指南
WHO: Laboratory Testing for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus：interim recommendations (revised) . (September 2014  ） US CDC：Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Patients Under Investigation (PUIs) for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) - Version 2

4 MERS-CoV感染标本采集对象 中东呼吸综合征冠状病毒感染疑似病例、临床 诊断病例及需要进一步研究的确诊病例；

5 标本采集要求 从事MERS-CoV检测标本采集的技术人员应经过生物安全 培训，培训合格且具备相应的实验技能。在标本采集过 程中，采样人员进行安全防护。 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专 业人员指导下采集。 密切接触者标本由当地疾控机构负责采集。 根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。

6 采集标本种类和要求 呼吸道（上、下呼吸道）和其他样品（血清、尿液和粪 便）、尸检标本。
每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本，下呼吸道 标本最佳，建议同时采集粪便和尿液标本。 应尽可能采取发病初期和恢复期双份血清标本以确定是否 感染，双份血清样品间隔14~21天采集比较理想，第一份 血清应在发病第一周内采集。但单份样品的检测对于确定 疑似病例也有价值，如果只能采集一份样品，应该在出现 症状后至少14天采集。

7 标本的保存 样品采集后应尽快送至实验室，运输过程需合理。
若呼吸道样品72小时以上才能到达实验室，强烈 推荐将样品储存在-80℃并使用干冰进行运输，应 避免样品反复冻融。 从全血分离的血清应4℃储存并运输，或用干冰、 液氮冷冻并运输。由于无霜冰柜温度波动较大， 应避免使用无霜冰柜储存呼吸道和血清样品。

8 MERS-CoV感染标本包装和运输 院内转运时，标本应该放置在耐用、防渗透的二级容器中进行转 运。为减少任何标本破、漏的风险，不要使用任何气动传输系统 来转运任何可能疑似患者标本。 转运至CDC的MERS-CoV标本应该充分包裹，转运时不能开盖或 分装标本。标本转运应该符合三重包装系统要求：内层是主要的 容器（一个可密封的标本袋缠绕以可吸收材料），第二层是防水、 防渗漏的容器，外层是用于转运的包装。

9 MERS-CoV感染实验室检测方法 核酸检测：为目前早期诊断、早期发现MERS-CoV感染病例的主要检测方法，采用Real-time PCR 进行病毒核酸检测和诊断，患者呼吸道样本中扩增到特异性核酸，可确诊MERS-CoV感染 。传统RT-PCR因易出现污染使用受限，但可以获得病毒基因序列。 抗原抗体检测: IgM捕获法ELISA检测血清特异性IgM抗体 间接法ELISA或免疫荧光方法检测IgG抗体 利用假病毒进行中和抗体检测

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11 MERS-CoV的实验室检测靶标 目前病毒核酸的检测方法主要有：检测E蛋白上游 基因（upE）、ORF1b、ORF1a 、 N2基因四种。
另外，已确定了中东呼吸综合征冠状病毒基因组 中位于RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和衣壳蛋 白（N）基因的几个适合测序验证的靶序列。

12 实验方案 标本采集 核酸提取 逆转录，获得cDNA PCR检测 荧光定量 PCR 巢式PCR 普通PCR PCR产物电泳或测序

13 实验流程 抗原检测 抗体检测 病毒分离 待检样品 upE 特异性RT-PCR检测 阴性 阳性 ORF1a RT-PCR检测 阴性 阳性
RdRp测序或N 测序 阴性 阳性 确 诊

14 入选病例 继续采样，如有必要应送样至有MERS-CoV检测经验的参比实验室进行检测 rRT-PCR upE基因进行筛查实验 阳性 阴性
rRT-PCR ORF1a、ORF1b或N基因区进行确证实验 阴性，但如果临床和流行病学证据充分，继续采样重复检测 RdRp或N区测序实验 显示为其他序列 显示MERS-CoV 确诊病例

15 分子检测引物与探针 upE upE-Fwd 5'-GCAACGCGCGATTCAGTT-3'
upE-Rev '-GCCTCTACACGGGACCCATA-3' upE-Prb 'FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3' ORF1b ORF1b-Fwd '-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3' ORF1b-Rev '-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3' ORF1b-Prb 'FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3' ORF1a ORF1a-Fwd 5'- CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3' ORF1a-Rev 5'- CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3' ORF1a-Prb 'FAM- TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAMRA 3' N2 N2-Fwd '- GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3' N2-Rev '- TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3' N2-Prb 'FAM- ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3'

16 1e e e e2 Y=-3.56x+39.19 R2=0.988

17 荧光定量RT-PCR检测结果判断 阴性: 无Ct值或Ct为40。 阳性：Ct值<37, 可报告为阳性。

18 MERS-CoV核酸检测结果报告 在实验室要确认一个样本为阳性，需要满足以下两个条件的其中一个：
至少两种MERS-CoV特异性PCR结果阳性； 一种PCR结果为阳性，另外一种PCR产物序列测序，与MERS-CoV序列相符。 当针对MERS-CoV的两种不同的检测方法结果不一致的时候，应当采用反转录PCR扩增，对扩增产物进行测序以确认检测结果。

19 检测结果判读 阴性结果也不能排除临床病人的感染，一些因素可能产生假阴性，包括：
样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本； 样本收集的过早或过晚； 没有正确的保存、运输和处理样本； 技术本身存在的原因，如病毒变异，PCR抑制等。 当PCR检测结果为阴性，但临床表现和流行病学特点提示是MERS-CoV感染时，可采用血清学方法进行检测。双份血清标本能够满足血清学检测的要求。

20 我国首例输入性中东呼吸综合征病例的 实验室快速确诊
2015年5月27日晚10时世界卫生组织向中国卫生计生委通 报，韩国1例确诊中东呼吸综合征（MERS）病例的密切接 触者经香港入境广东省惠州市。 5月28日下午，经广东省疾控中心对病例标本进行核酸检 测，初筛结果为阳性。 样本接收时间： 日凌晨1点40分（中国疾控中心 病毒病所） 实验室确诊结果上报： 日凌晨5点40分

21 疑似MERS-CoV感染的实验室快速确诊
样本来源：KIM MYEONGSHIK (韩国）广东省惠州市 样本类型：鼻咽拭子(3份） 血清(1份） 采样日期： 实验室复核检测流程： BSL-3实验室：分装灭活 BSL-2实验室：核酸提取 荧光定量RT-PCR (三个靶标UpE、ORF1b和N2) 结果判定与报告

22 广东省CDC疑似MERS-CoV感染的复核检测
N2检测扩增曲线 UpE检测扩增曲线 ORF1b检测扩增曲线

23 疑似MERS-CoV感染的送检样本复核检测
荧光定量RT-PCR检测结果（Ct 值） 靶标 鼻咽拭子 血 （－） （＋） 1 2 3 UpE 34.18 33.9 33.84 No Ct 25.51 ORF1b 35.85 35.16 34.73 27.95 N2 31.21 31.27 30.76 36.5 ND 21.34

24 结论 采用upE/ORF1b/N2 三个靶标，进行三种荧光定量 RT-PCR扩增，在对照成立的基础上，三管咽拭子 样本检测结果皆为阳性。
结论：广东疑似MERS-CoV病人实验室检测确定 为MERS-CoV感染阳性。

25 上海辉瑞合作研发试剂盒（单管双靶标）应用验证
MERS-CoV RNA双色检测试剂盒ORF1b/upE （FAM/VIC） 样品编号 CT值 1 阳性对照 22.58 2 咽拭子样本 36.35 样品编号 CT值 3 阳性对照 22.54 4 咽拭子样本 33.17

26 基于浊度仪和羟基萘酚蓝颜色变化的简单快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术
RT-LAMP检测方法的特异性浊度图和显色图 特异性高，检测下限分别为每管反应500与1000拷贝，有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选，具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力

27 RT-PCR扩增RdRp或N基因后测序检测MERS-CoV
RdRpSeq assay: EMC-SeqRdRP-Rev: GCA TWG CNC WGT CAC ACT TAG G EMC-SeqRdRP-Fwd: TGC TAT WAG TGC TAA GAA TAG RGC EMC-SeqRdRP-Rnest: CAC TTA GGR TAR TCC CAW CCC A W=A/T, N=A/C/T/G, R=A/G Fragment size: first round : 242bp (including primers), second round 228 bp (including primers) Nseq assay: EMC-SeqN-Fwd: CCT TCG GTA CAG TGG AGC CA EMC-SeqN-Rev: GAT GGG GTT GCC AAA CAC AAA C EMC-SeqN-Fnest: TGA CCC AAA GAA TCC CAA CTA C Fragment size: first round : bp (including primers), second round bp (including primers) Reference: Corman/Müller et al.; Eurosurveillance, Volume 17, Issue 49, 06 December 2012

28 冠状病毒通用引物RT-PCR扩增产物电泳
通用引物检测冠状病毒 引物对序列： Cor-FW (5'-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3') Cor-RV (5'-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3‘) 冠状病毒通用引物RT-PCR扩增产物电泳 One-step RT-PCR assays (OneStep RT-PCR kit； QIAGEN) 反应条件： 1. 反转录: 50℃ for 30min 2. PCR扩增: 95 ℃ for 15 min (激活)，50 cycles (30 sec at 94 ℃；30 sec at 48 ℃；1min at 72 ℃ )，最后延伸 72 ℃ for 10min。

29 IFA抗原片检测MERS-CoV特异抗体

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31 中和抗体检测 利用MERS-CoV假病毒体系进行中和抗体检测，实验操作简单而不受BSL-3实验室的限制（Virology Journal.2013;10(1):266)。

32 中国CDC目前实验室检测 相关技术储备与培训
已引进MERS-CoV 病毒毒株； 建立分子检测技术，形成SOP，成功完成了广东MERS-CoV疑似病例的实验室复核工作，完成病毒全基因组的测序； 建立MERS-CoV假病毒检测中和抗体的技术； 撰写并颁布《中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）实验室检测技术指南》； 组织召开2期全国中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）实验室检测技术培训班，参与培训人员来自中国疾控中心与各省市疾控中心及不明原因肺炎网络实验室管理与技术人员，并发放检测试剂盒数千人份。

33 谢谢