第七节 分子杂交技术.

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1 第七节 分子杂交技术

2 一. 分子杂交种类 1. 按其分子种类划分 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA
2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体

3 2. 按样品制备过程划分 2）斑点杂交(dot hybridization) 1） 原位杂交(in situ hybridization)
ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交 原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2）斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。

4 3）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization)
先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法 4) 夹心杂交法(sandwich hybridization) 它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品

5 二. 杂交样品膜的制备 3. 分子杂交的一般程序 1) DNA和RNA的杂交
2）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反应（EIA） 或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA） 二. 杂交样品膜的制备 1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）

6 3) 尼龙膜 优点：i. 用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。
ii. 用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要预激活；易于操作 缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次） 2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 3) 尼龙膜 i. 阳离子尼龙膜（如Zeta-prob,Zeta-bind等）

7 i) 容量大, 蛋白质可结合480μg/cm2 ii) 可结合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白质。 iii) 韧性好 iv) 可用于电转移 v) 可进行反复多次杂交试验 vi) 广泛的化学耐受性和可高温消毒 *不能用于蛋白质的直接染色。 ii. 尼龙66 广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态，电转移时要注意。 4）离子膜 i. DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制备回收) ii. CM-纤维素纸 (可用于碱性蛋白质的结合)

8 2. 固定基质的选择依据 3. 各种杂交样品膜的制备 2）高信噪比（低本底高信号） 3）生物大分子的结合容量和稳定性 4）重现性好
1）强度，耐久性，操作简便 2）高信噪比（低本底高信号） 3）生物大分子的结合容量和稳定性 4）重现性好 3. 各种杂交样品膜的制备 1）原位杂交样品膜的制备 i. 原位菌落杂交样品膜

9 i) 细胞培养（高密度，几百—十万个菌落或低密度，几百个以下）
ii) 细菌细胞原位裂解与DNA变性 ii. 原位噬菌斑杂交样品膜 i) 细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌体转移—用NCF作影印 iii) DNA变性与固定（与上同）

10 3）转移杂交样品膜的制备 2） 斑点杂交样品膜的制备 制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪或直接点样）
i. 扩散法（Difusion blotting method )

11 ii. 毛细管法 (Capillary blotting method )
Southern 印迹

12 iii. 电转移法 (electro blotting )
iv. 真空转移法 (Vaccum bllotting ) 转移速度与凝胶的速度和厚度成反比，在相同转移率（50%）时，真空法比毛细管法快13倍，其损失仅6%，而毛细管法损失率20%。

13 v. 各种转移方法的比较 i) 扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。 vi. 转移的最佳条件 i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 　对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。

14 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟）→水洗→0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→转移。
对于大分子蛋白质，可采用下述三种方法之一： 解偶联剂使凝胶解聚；蛋白酶作用；转移缓冲液中加入SDS。 三. 标记探针的制备 1. 标记化合物的种类 1）放射性同位素标记物 125I，3H，14C用于蛋白质标记；32P，3H，35S 用于核酸标记，其中32P和35S使用频率高。32P标记核苷酸的α位或γ位，35S则是标记核苷酸的α位.

15 2) 非放射性标记物 i. 生物素 分离自蛋黄的水溶性维生素，它可以和分离自蛋清中的一种碱性蛋白—抗生物素蛋白牢固地结合。每个抗生物素蛋白可结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更牢固，可大大提高其灵敏度。 生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合物。 ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。 地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。

16 3) 两类标记化合物的比较 iii. 蛋白质检测标记物 i) 酶偶联二抗（0.05ng）
ii) 蛋白质A（来自金黄色葡萄球菌）。可作用于大多数哺乳动物的IgG，灵敏度较低（5ng） iii) 免疫金（immunogold） ng 3) 两类标记化合物的比较 i. 灵敏度 i ) 检测蛋白质，两种方法差不多。 ii) 检测核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 稳定性 酶法探针可在4℃保存一年，放射性标记需每次制备。 iii. 安全性 非放射性标记安全。 iv. 效率 非放射性标记所需时间短。

17 2. 标记探针的制备 1）链标记法 i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP)
ii. 随机DNA引物延伸法 ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P) iii. 反转录法 mRNA+dNTP(32P) →cDNA（标记） iv. 转录法 含有待标记DNA片段的重组质粒+NTP(32P)→→RNA（标记） SP6聚合酶 v. 引物延伸法 含待标记DNA的单链DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待标记DNA链

18 vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNA→T4 DNA聚合酶, 无dNTP→3’-5’外切酶活性→加入dNTP和标记核苷酸→新合成链（32P） 2) 末端标记 i. 5’-末端标记 ss-和ds-DNA, RNA→脱磷酸化反应 (CIP) → T4DNA激酶(γ-32P )ATP ii. 3’-末端标记 i) TdT加尾反应，用于dsDNA ii) 补齐反应

19 iii) T4 RNA连接酶反应 RNA-OH+*pNp（3’-5’-二磷酸核苷）+ATP—RNA-*pNPp+pA+ppi
3) 标记化合物的纯化 i. 柱层析 利用Sephadex G-50，前峰-标记物，后峰-核苷酸 ii. 旋转柱层析 快速，简便, 可同时纯化多个样品。 四. 分子杂交与结果检测 1. 核酸杂交与结果检测 1）预杂交： 预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是cDNA或RNA，预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合, 42℃ 4-6h或过夜。 2）杂交：探针100℃变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42℃一天

20 3）洗涤：2×SSC+0. 1%SDS常温洗涤两次，1×SSC+0
3）洗涤：2×SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，1×SSC+0.1%SDS 65℃洗涤两次，每次15分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算： T=4GC+2AT * 高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，采用高强度杂交条件；若使低同源性DNA之间杂交，则采用低强度杂交条件。这两种条件之差异表现在杂交液和洗涤液的离子强度以及杂交和洗涤时的温度。 4）放射自显影或显色反应 使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。若采用非放射性同位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。主要有两种酶： i. 辣根过氧化物酶: 可将3，3’-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将4-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。

21 ii. 碱性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，该化合物可转变为兰色沉淀物，该反应中释放的氢离子可将硝基兰四唑还原成深紫色沉淀，这些沉淀物都是沉积在酶的作用位点。
iii. 两种酶偶联物的比较 i) 碱性磷酸酶的灵敏度比辣根过氧化物酶高10倍左右，但噪声大。 ii) 碱性磷酸酶的显色反应可持续几个小时，其显色结果可长期保存，但辣根过氧化物酶的显色反应仅能持续30分钟。 5) 杂交结果 2. 蛋白质的免疫分析 封闭剂，明胶，牛血清蛋白，卵清蛋白等。

22 杂交结果示意图

23 第八节 核酸序列的测定

24 一. DNA的核苷酸序列分析 1. 种类 1) 酶法 i. 加减法
ss-DNA→与引物退火→加入4种dNTP和DNA聚合酶→分离纯化ds-DNA→加减法定序系统测序。 加法系统：ds-DNA 4份，每份中加入一种脱氧核苷酸和DNA聚合酶。 减法系统；ds-DNA 4份，每份加入三种脱氧核苷酸和DNA聚合酶。 该法操作复杂，读序较难，但其前半部反应可在其他定序方法中用于序列延伸。

25 ii. 双脱氧核苷酸链终止法(dideoxy-termination sequencing)
原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’ 端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。

26 过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。`
该法亦适合mRNA的序列分析。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。 2) 化学法 原理：DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生碱基脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列。

27 i. 嘌呤（A和G）序列测定 硫酸二甲酯处理DNA链时，G的7位和A的3位氮原子被甲基化，甲基化后的嘌呤环可被哌啶取代，从而导致链断裂。由于G比A 更易甲基化（5倍），且mG比mA更不稳定，因而易发生链断裂。控制好反应温度与时间，只使G反应而A不反应，从而可测出G序列。 若用甲酯代替硫酸二甲酯，A与G均会发生反应。比较两反应系统电泳结果，就可知道A的序列。 ii. 嘧啶（C和T）序列的测定 用肼处理ss-DNA时，可使嘧啶开环，被哌啶取代后而导致磷酸二酯键断裂。若反应在高盐浓度下进行，T与肼的反应受抑制，因而可测得C的序列，比较加盐与不加盐反应的结果，就可测定T的序列。 该法的一大优点是不需要模板，引物和DNA聚合酶。待测DNA链的检测用32p末端标记。

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31 酶法测序(Sanger) 化学测序法(Maxam-Gilbert) 待测DNA片段 待测DNA片段
↓ ↓ 次克隆 ’-末端标记 ↓ 筛选重组子 链分离 限制酶切 模板增殖与纯化 ↓ ↓ 纯化标记的ss-DNA 与引物退火 ↓ ↓ 定序反应 定序反应 聚丙烯酰胺凝胶电泳 真空干燥 放射自显影 阅读序列和计算机录入 核苷酸序列的分析与比较

32 3. 两种定序方法的比较 1) 化学法 i. 优点: 所有片段具有相同的标记强度；一次可以读出 个核苷酸；定序分析不需要次克隆；不受二级结构区的影响；多A区定序清楚；适合500bp或以下DNA片段的定序分析。 ii. 缺点: 需限制酶图；需放射自显影时间较长和增感屏；DNA片段需经凝胶纯化； 多嘧啶区定序不够清楚；所用试剂为诱变剂和致癌物质。 2) 酶法 i.优点: 反应简单，易于操作；具有配套载体和宿主菌；不一定需要详尽的限制酶图；可采用多种方法进行次克隆。 ii.缺点: DNA带放射强度不均匀；下游碱基阅读困难；需要大量的次克隆和鉴定工作；二级结构区和多C区定序困难。 定序方法的选择主要依据所需测序DNA长度，实验目的等。

33 二. 酶法定序系统 1. 单链定序系统 1）M13mp 系列载体定序系统
i. 从细菌细胞中获得ds-DNA，以利待测DNA片段的重组，经转化进入细胞； ii. 从培养液中可获得病毒颗粒，从中提取ss-DNA用于测序，病毒颗粒经感染将-DNA引入细胞； iii. 含有β-半乳糖甘酶α-链基因，易于重组子检测； iv. 多克隆位点区有利于外源DNA插入，因配套载体的多克隆位点区方向相反，有利于待测DNA端靠近载体上的引物变性区； v. 各种引物易于获得； vi.有与载体配套的各种宿主菌，如：E.coliJM系列，DH5αF’ 等。

34 2)噬粒载体定序系统 该系统具上述M13mp系统的特点外，它容纳的外源DNA片段较长；直接在同一重组分子进行各种次克隆；操作较简单，同时亦可用于双链定序。 与M13mp系统相比较，噬粒载体系统有以下两缺点： i. 形成单链时需辅助噬菌体，它亦可形成病毒颗粒； ii. 制备ss-DNA时需较大量培养液，而M13mp系列载体仅需 1.5ml培养液即可。 2. 双链定序系统 任何一种质粒载体质粒载体均可用于此目的，只要有适合的引物。该系统的一个最大优点是操作简单，可进行双向定序，大大减少次克隆工作量。 与单链定序系统相比较，该系统每次可阅读序列较少，反应中其他干扰较多。

35 3．测序引物，同位素和酶 1）引物 正向引物与反向引物：凡是含有LacZα基因失活的标记基因的各种载体，与多克隆位点区下游某序列可复性的引物称为正向引物（forward primer）；反之，位于多克隆位点区上游的引物称之为反向引物（reversed primer） 当使用噬粒载体定序时，一定要注意包装入噬菌体中单链是+或-链，相应引物只能选用一种。

36 2）同位素 如果是作链标记，常用的同位素是[α-32P]-dATP或[α-35S]dATP，其放射比活性较低。如果是做引物标记，则用[γ-32P]ATP。 当用PCR方法定序时，则常采用引物的5'-端标记。 3）聚合酶 可用DNA polI K，TTDNA聚合酶，DNA定序酶，Tag DNA pol等。 除上述因素外，不同测序系统中使用的dNTP/ddNTP比值对定序结果影响也很大。

37 三. DNA序列的快速测定 快速测定DNA序列应同时从以下两方面考虑：
i. 每次定序反应的核苷酸序列可读数尽可能大，可大大减轻次克隆的工作量； ii. 提高次克隆效率，使一次反应就能获得所需的全部重组体，尽量减少重组子鉴定步骤。 1. 延伸DNA定序方法 ss-DNA模板→与引物退火→加入dNTP和DNApol反应约5’（室温）→分为4个反应系统进行→双脱氧核苷酸定序（37℃5分钟）→凝胶电泳→放射自显影→读序。 2. DNA片段的次克隆方法

38 1）限制酶切法 必备条件：详尽限制酶图；各切点序列必须为另一次克隆片段测序时覆盖。 2）双向缺失法

39 3）单向缺失法 4）鸟枪法（随机片段法）

40 3. 特殊缺失法 1）洪国藩法 2）郭礼和法

41 3）单链缺失法

42 4）直接顺序缺失法 4.多引物测序

43 四. DNA序列测定的自动化 2.自动测序仪 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化
1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化 3）凝胶电泳 自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。 4）核苷酸序列阅读与计算机输入 可自动化 2.自动测序仪 Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）

44 优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；
ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。 缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰, 导致读序时分辨率下降。

45 3.直接印迹电泳 该装置可将放射性DNA带直接电泳到固体基质上。 常规电泳中，可采用以下两种方法提高读序数目： i. 延长凝胶长度 ii. 分次点样: 同块板分两次点样；两块板一次点样，但电泳时间不同 （当DNA样品多时，最好是两块板一次点样，采用不同电泳时间)