肺結核痰液抹片檢查及鑑定暨臨床教師技能訓練

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1 肺結核痰液抹片檢查及鑑定暨臨床教師技能訓練
蔣佳蓉

2 Identification and Drug susceptible Test
Negative pressure room for sputum collection Smear, Culture and PCR Specimen decontamination before treatment

3 結核桿菌抹片作業

4 檢驗目的 顯微鏡鏡檢法是在臨床檢體中確認感染分枝桿菌疾病的最快速方法，利用此項檢查能偵測檢體中是否含有分枝桿菌屬。分枝桿菌屬鏡檢法可提供醫生很多用途，包括(1)能迅速確認病人是否被感染，提供作為初步診斷結核菌感染的參考，(2)能監測病人接受藥物治療進行的狀況，(3)確認培養出的菌落為分枝桿菌。

5 檢驗原理 利用分枝桿菌細胞壁富含mycolic acid的性質，一旦被aniline dye或basic fuchsin染上，就很難被酸性酒精脫色之特性，可與其他菌屬區分出。

6 原始檢體種類 適用於人體之痰、尿、體液（含腦脊髓液、肋膜液、腹膜液）、胃抽出液、組織、糞便等。

7 結核菌檢體包裝 檢體須以50mL 離心管密封鎖緊 檢體容器外應標示病患姓名、送驗疾病、barcode 、檢體種類、
採檢部位或其他規定該標示項目 裝入檢體瓶中

8 結核菌檢體採檢 檢體種類：痰(用力咳出肺部深處的痰)，痰量至少3-5 mL 檢體容器：50mL離心管
採檢時間：初次驗痰應以未服藥前採檢為宜，建議採集三次；至少有一次為清晨第一口痰檢體為佳

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10 檢驗項目 抗酸菌染色檢查。 結核菌培養檢查。 抗酸菌鑑定 抗酸菌藥物敏感性試驗 健保結核分枝桿菌分子檢測(PCR)。
QuantiFERON-TB試劑分析結核病患者之高危險潛伏族群(疾病管制局委託執行) 。 Geno-type(MDR)

11 痰檢體(濃縮法) 1 以無菌滴管吸取3-5 mL痰液至50 mL離心管 2 加等量的無菌NALC-3.5%NaOH液化痰液 3 振盪器振盪約15-20秒。(如痰未液化完全，則依需要再振盪幾秒但時間不宜超過30秒) 4 室溫靜置15分鐘

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13 Microscopy fluorescent stain + - acid fast stain Microscopy
Negative results acid fast stain

14 抹片判讀

15 注意事項 - 避免酸性酒精脫色不完全 大部份結核菌為強抗酸菌不容易被脫色，若酸性酒精脫色不完全會造成偽陽性。抹片太厚不易脫色時，加上背景染色容易掩蓋抗酸菌造成偽陰性 - Ziehl-Neelsen法之Carbolfuchsin濃度較低(0.3%)，需加熱較麻煩，但放久較不會褪色。Kinyoun法則複紅濃度較高(3%)，不必加熱，較方便，但可能較會褪色。國際抗癆聯盟專家，較推薦Ziehl-Neelsen法

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17 結核菌的鑑定方法 傳統鑑定 ICA(快速鑑定) PCR 生物晶片分型 PCR-RFLP 基因定序(Sequence)

18 Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC)
Mycobacterium bovis Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium africanum Mycobacterium microti PCR Target- 273 bp IS6110 fragment

19 結核桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex)
結核菌的鑑定目的 利用相關檢測陽性培養菌株，鑑定是否為 結核桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex) 非結核性分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacteria)。

20 ICA (快速鑑定) 檢驗原理 利用快速免疫呈色法，針對結核菌群(MTbc)抗原進行定性偵測。本產品偵測結核菌群細胞分泌的MPT64蛋白片段，當檢體與試劑進行反應時，檢體中的MPT64抗原會與試劑中的MPT64抗體結合，MPT64抗原-抗體複合物會在試劑的反應區被次級MPT64抗體所辨認結合進而由膠狀金質顆粒產生紅色至粉紅色的線條顏色

21 ICA (快速鑑定) 1.MGIT tube呈現陽性之後經抗酸性染色確定陽性再用 ICA(快速鑑定)試劑組。
液體培養基 1.MGIT tube呈現陽性之後經抗酸性染色確定陽性再用 ICA(快速鑑定)試劑組。 2.ICA(快速鑑定) 試劑組必須回溫至室溫下使用。 3.拆開試劑包裝並放置於平坦的桌面。 4.在試劑上標明病人資料。 5.將呈現陽性的MGIT tube均勻混合。 6.打開MGIT tube蓋子，用無菌的pipette tips或無菌吸 管取100 μl檢體加到已標示病人資料的試劑區，關上 MGIT tube蓋子， 開始計時15分鐘後進行判讀，切勿 超過60分鐘判讀。

22 ICA (快速鑑定) 固體培養基 取菌落3-4個菌落加入200μl7H9broth或無菌 水調成懸浮液。如固體培養基內有凝結液直接用
無菌的pipette tips或無菌吸管取凝結液100 μl檢體加到已標示病人資料的試劑接種區(標示 為 )開始計時15分鐘後進行判讀，切勿超過60分 鐘判讀。

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24 生物晶片(Myco Chip)效能 利用核酸放大及雜交反應之定性方法，篩檢經過培養之抗酸染色陽性檢體，可檢測肺結核分枝桿菌以及15種非結核分枝桿菌分型，同時鑑定肺結核分枝桿菌對Rifampicin 的藥物敏感性。

25 DR. Chip Biotechnology Incorporation
Microarray Plate DR. Poly Chip 96-well Microplate

26 DR. AiM Soft analysis result
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27 謝謝聆聽