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呼伦贝尔学院优秀课 第 三 章 病毒和亚病毒因子 Virus and subvirus 高明华 呼伦贝尔学院
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（真）病毒:至少含有核酸和蛋白质二种组分
非细胞 生物 类病毒：只含具有独立侵染性的RNA组分 拟病毒:只含不具独立侵染性的RNA组分 卫星病毒：与真病毒伴生的缺陷病毒 卫星RNA：只含与侵染无关的RNA组分 朊病毒：只含单一蛋白质 亚病毒 因子
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第一节 病 毒 课时目标： E：病毒的致病机制与防治方法是我们当今研究的热点； D：流感病毒、狂犬病病毒、艾滋病病毒结构与人类疾病；
第一节 病 毒 课时目标： E：病毒的致病机制与防治方法是我们当今研究的热点； D：流感病毒、狂犬病病毒、艾滋病病毒结构与人类疾病； C：病毒的概念；病毒的特点；病毒的形态与构造； B：病毒的复制过程； A：病毒的宿主范围；分类与命名；噬菌体的溶源性； 重点：病毒的特点；病毒的形态与构造； 难点：病毒的复制过程； 课后作业：P86-2、8；
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第一节 病 毒 (Virus) 病毒的概念：是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子，它们能以感染态和非感染态两种状态存在。 Definition: Viruses are small and noncellular infectious entities whose genomes are a nucleic acid, either DNA or RNA; which reproduce only in living cells by replication. 病毒的分类： DNA病毒和RNA病毒；噬菌体、噬放线菌体、噬真菌体、噬藻体、植物病毒、人类和脊椎动物病毒、昆虫病毒；亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒） 3个目、73个科、11个亚科、289个属、1950个种（2005.7）
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病 毒 的 特 性 1、形体极其微小，必须在在电镜下才能观察； 2、没有细胞结构，主要成分仅为核酸和蛋白质两种，又称“分子生物”；
病 毒 的 特 性 1、形体极其微小，必须在在电镜下才能观察； 2、没有细胞结构，主要成分仅为核酸和蛋白质两种，又称“分子生物”； 3、只含有一种核酸，DNA/RNA，或没有核酸； 4、既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶； 5、以核酸和蛋白质等“元件”的装配实现其大量繁殖； 6、在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并可长期保持 其侵染活力； 7、对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感； 8、有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染；
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一、病毒的形态、构造和化学成分 （一）病毒的大小
Viruses are so small that they can only be seen at magnifications provided by the electron microscope. They are 10~100 times smaller than most bacteria, with an approximate size range of 15~300nm. Thus they pass through the pores of filters which do not permit the passage of most bacteria.
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Comparative Sizes of viruses and Bacteria
（二）病毒的形态 Comparative Sizes of viruses and Bacteria Different virus species are shown here to scale inside an E.coli bacterium
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1、典型病毒粒的构造 病毒粒（Virion）: The structurally complete mature and infectious virus is called the virion. 核酸——位于中心，称为核心 基本成分 蛋白质——包围在核心周围，形成衣壳 核心和衣壳合称核衣壳，为病毒的基本结构。 结构简单的病毒：核衣壳 结构复杂的病毒：在衣壳的外面包裹着一层由脂类和多糖组成的包膜。有的包膜上还长有刺突。
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病毒粒子的结构 Virus particle structure
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Human Influenza Virus
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Virus with Helical Symmetry
Envelope Myxovirus
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乙型肝炎病毒的结构及表面抗原
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Model of rabies virus particle structure
Photo of rabies virus particles (TEM)
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人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的结构
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2、病毒粒的对称体制 对称体制 无包膜 螺旋对称 有包膜 二十面体对称 有包膜：疱疹病毒 无包膜： E.coli 偶数噬菌体 复合对称
有包膜：痘病毒 对称体制 杆状：TMV 丝状：E.coli fl,fd,M13 卷曲状：流感病毒 弹状：Rabies virus 大型：腺病毒 小型：脊髓灰质炎病毒
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（三）3类典型形态的病毒及其代表 1、螺旋状对称型：烟草花叶病毒（TMV）
呈直杆状，长300nm，宽15nm，中空内径4nm，由158个氨基酸组成一个皮鞋状的衣壳粒，总共2130个衣壳粒，排列成130圈螺旋，核酸核心是ssRNA，每3个核苷酸与一个衣壳粒相结合，盘绕于蛋白质的中空内径中。基因组为6 390nt。
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2、二十面体（立方体）对称型：腺病毒 二十面体具有12个角、20个面 和30条棱。腺病毒的衣壳是典型的二十面体对称， 由252个衣壳粒组成，没有包膜。腺病毒的核心是由线状dsDNA构成的。基因组的大小都约为36 500bp。
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3、复合对称型：Ｔ偶数噬菌体 T4由头部（二十面体对称 ）和尾部（螺旋状对称）两个部分构成。
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蛋白质 核酸 其他成分 二、病毒的分类（简介）,P72 （四）病毒的核酸（基因组）及化学组成 衣壳 酶 单链DNA（ss DNA）
双链DNA（ds DNA） 双链RNA（ds RNA） 单链RNA（ss RNA） 核酸 +RNA -RNA 其他成分 二、病毒的分类（简介）,P72
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病毒的群体形态 噬菌斑：噬菌体感染细菌后，使细菌细胞破裂死亡，连续重复感染使大量的细菌死亡，在培养细菌的平板上，可以看到一个个透明不长细菌的小圆斑，称为噬菌斑。 空斑：人工培养的单层动物细胞感染病毒后，也会形成类似噬菌斑的动物病毒群体，称为空斑。 病斑：单层动物细胞受到肿瘤病毒的感染后，会使动物细胞恶性增生，形成类似细菌菌落的病灶，称为病斑。 枯斑：烟草花叶病毒感染烟草后，在叶片上出现的一个个坏死的病灶，称为枯斑。
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三、4类病毒及其繁殖方式 复制的过程： 吸附----侵入----脱壳-----生物合成------装配-----释放
吸附----侵入----增殖-----成熟-----释放（E. coli T4）
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一 、噬菌体，phage 与其他病毒一样，噬菌体除有其 特异性宿主外，并无显著区别。 它们都是由蛋白质和核酸组成。 基本形态为蝌蚪形、球形、和丝 状三种。
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1、噬菌体的繁殖 病毒粒子并无个体的生长过程，而只有其两种基本成分的合成和装配。 即：核酸复制+蛋白质合成 = 核衣壳（病毒粒子）
即：核酸复制+蛋白质合成 = 核衣壳（病毒粒子） 噬菌体的繁殖一般可分五个阶段，即 吸附 侵入（脱壳） 增殖（复制与生物合成） 成熟（装配） 裂解（释放） Virulent phage and lytic cycle；temperate phage
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（1）吸附，adsorption、attachment
病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。 尾丝尖端与宿主细胞表面的特异性受体（脂多糖）接触，可触发尾丝散开，附着在受体上，随之把刺突、基板固定
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（2）侵入，penetration、injection
尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖， 使细胞壁产生小孔；尾鞘收缩， 核酸通过中空的尾管压入胞内， 蛋白质外壳留在胞外； 从吸附到侵入，时间间隔很短，只有几秒到几分钟。 吸附 尾钉固着 尾鞘收缩 尾管穿入 DNA注入
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病毒侵入的方式取决于宿主细胞的性质尤其是其表面结构，至少有四种方式：
（1）借吞噬作用或吞饮病毒将整个病毒粒子包入敏感细胞，如痘类病毒； （2）具脂蛋白囊膜的的病毒，其囊膜与细胞膜融合或相互作用脱去囊膜，核衣壳直接侵入细胞质中，如流感病毒； （3）某些病毒粒子与宿主细胞膜上的受体相互作用，使核衣壳侵入细胞中，如脊髓灰质炎病毒； （4）有的病毒能以完整的病毒粒子直接通过宿主细胞膜穿入细胞质中，如呼肠孤病毒。
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（3）增殖，replication 病毒利用宿主的生物合成机构和场所，完成病毒核酸复制和蛋白质的合成。
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病 毒复制
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（4）成熟，maturity（装配，assembly）
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（5）裂解，lysis（释放，release）
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吸附 侵入 早期：病毒特异性酶的合成 病毒大分 子合成 病毒核酸复制 病毒结构蛋白质合成 装配 释放
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2、噬菌体的溶源性（lysogeny） 烈性噬菌体： 温和噬菌体（溶源性噬菌体）： 表示方法：E. coli k12（λ）
溶源性细菌：含有温和噬菌体的DNA 而又找不到形态上可见的噬菌体粒子的宿主细菌叫溶源性细菌。
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温和噬菌体的存在形式： ① 游离态; ② 前噬菌体（prophage）; ③ 营养态; 溶源性(lysogeny)现象: 感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。这一现象称做溶源性现象。
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噬菌体效价的测定 效价(噬班形成单位，pfu): 每毫升试样中所含的具有侵染性的噬菌体粒子数。 双层平板法
Quantification of a Bacterial by Plaque Assay
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3、一步生长曲线 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线称作一步生长曲线。它包括：潜伏期、裂解期和裂解量。 一步生长曲线可分为三个时期：
①潜伏期: 是指菌体的核酸侵入宿主细胞后至第 一个噬菌体粒子装配前的一段时间。 包括：隐晦期和胞内积累期； ②裂解期: 是指溶液中噬菌体粒子急剧增多的一 段时间。 ③稳定期: 溶液中噬菌体总数达到最高点后的时期。
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裂解量：平均每一宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数。
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二 植物病毒 植物病毒没有专门的吸附结构，通过昆虫口器、摩擦伤口和人为伤口进入寄主细胞。植物病毒在入住宿主细胞后脱去蛋白质外壳。
二 植物病毒 植物病毒没有专门的吸附结构，通过昆虫口器、摩擦伤口和人为伤口进入寄主细胞。植物病毒在入住宿主细胞后脱去蛋白质外壳。 吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配、释放。
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三 人类和脊椎动物病毒 脊椎动物病毒包括DNA和RNA病毒。 核酸类型有：dsDNA和ssDNA 、dsRNA和ssRNA
三 人类和脊椎动物病毒 脊椎动物病毒包括DNA和RNA病毒。 核酸类型有：dsDNA和ssDNA 、dsRNA和ssRNA 腺病毒的复制可代表DNA病毒的复制； 人类免疫缺陷病毒的复制可代表RNA病毒的复制；
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腺病毒的复制 1. 吸附：腺病毒吸附在宿主细 胞表面的糖蛋白受体上。 2. 穿入：通过吞噬作用进入胞内。
3. 脱壳：寄主细胞的蛋白酶水解腺病毒衣壳。 5. 生物合成： 6. 装配： 7. 动物病毒的释放方式： 多种多样主要有以下几种形式：腺病毒通过细胞裂解或局部破裂而释放。
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一些带有囊膜的病毒，如单纯疱疹病毒，当它们的核酸和衣壳蛋白组装完毕后，它们将以“出芽”的方式，包裹寄主细胞的细胞膜或核膜，从寄主细胞中释放出来。
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人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的结构
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引起爱滋病的病毒——人类免疫缺陷病毒（HIV）
从淋巴细胞中释放出来
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HIV在细胞内生活周期
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HIV在细胞内生活周期
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三 昆虫病毒 多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体，称多角体（polyhedron）,直径一般为3μm(0.5~10),为碱溶性结晶蛋白，其中包裹着数目不等的病毒粒子。 1、核型多角体病毒（NPV） 2、质型多角体病毒（CPV） 3、颗粒体病毒（GV）
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第二、三节 课时目标： D：朊病毒与人类疾病； C：病毒的实践应用； B：朊病毒产生的机制； A：类病毒、拟病毒、卫星病毒与卫星RNA；
重点：病毒的实践应用； 难点：朊病毒产生的机制； 课后作业：P86-23；
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第二节 亚病毒因子 凡在核酸和蛋白质两种成分中，只含其中之一的分子病原体，称为亚病毒（subvirus）。包括：类病毒、拟病毒和朊病毒。
1971年T.O.Diener阐明马铃薯纺锤形块茎病毒（PSTD）的病原是一种具有感染性和自主复制能力的低分子RNA，并命名为类病毒。 Randles 1981年发现了称之为拟病毒的植物病毒-斑驳病毒（VTMoV）。 S.B.Prusiner (1982)在研究羊瘙痒病时发现了朊病毒，并因此获1997 诺贝尔奖。
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一、类病毒（Viroid） 类病毒是裸露的，仅含一个单链环状低相对分子质量 RNA分子的病原体。
发现的第一个类病毒是马铃薯纺锤形块茎病类病毒(Potato Spindle tuber viroid，PSTV)，这是一种导致马铃薯严重减 产的病原体，棒状，无蛋白外壳。它仅含一个由359个核苷 酸组成的单链环状RNA分子(相对分子质量约 )。该 分子内有很多碱基(~70％)通过氢键配对而形成双螺旋区， 未配对碱基则形成内环。双螺旋区与内环交替排列形成一 个伸长的棒状分子。 类病毒RNA相对分子质量虽小，但能独立侵染寄主，侵 入寄主后也能自我复制，不需要辅助病毒。
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二、拟病毒（Virusoid） 一类被包裹在真病毒粒体内部的有缺陷的类病毒，被称为拟病毒。拟病毒极其微小，一般由裸露的RNA( nt)或DNA组成。 拟病毒含有两种RNA分子: RNA-1： 与一般病毒中的类似，线状单链，较大。RNA-2：与类病毒有相似的理化性质和结构，也是 环状的。不能单独侵染寄主和复制自身。有的还含有线状形式的RNA-3。 已发现的有：苜蓿暂时性条斑病毒（LTSV）、莨菪斑驳病毒（SNMV）、地下三叶草斑驳病毒（SCMoV）。
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三、朊病毒 (prion) PrPc PrPSc 胁迫 PrPc-PrPSc PrPSc-PrPSc
又称蛋白质侵染因子。朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。 电子显微镜下的朊病毒为杆状颗粒，直径25nm，长 nm(一般为 nm)，杆状颗粒不单独存在，而呈丛状排列，丛的大小与形状不一，颗粒丛所含颗粒多时可有 100 个。 错误折叠 PrPc PrPSc 胁迫 PrPc-PrPSc PrPSc-PrPSc
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羊瘙痒病是羊的一种中枢神经系统退化性紊乱疾病。表现为毛脱落，皮肤瘙痒，失去平衡和后肢麻痹等症状。这种“羊瘙痒病”的病原是经过近两个世纪的研究未能解决的一个谜。直至1982年，美国加洲大学旧金山分校动物病毒学家S.B.Prusiner发现羊瘙痒病是蛋白质侵染引起的疾病，并称为“Prion”即朊病毒。
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现在已经发现与朊病毒有关的疾病有羊瘙痒病、貂脑病、人的库鲁病（震颤病）、克-雅氏病和牛海绵状脑病（BSE）。有人还推测人类的一些慢性退化性紊乱疾病，像早老年痴呆，帕金森氏病、糖尿病、风湿性关节炎和红斑狼疮等疾病也可能是由朊病毒引起的。
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朊病毒的发病机制 错误折叠 PrPc PrPSc
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病毒分子生物学
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第三节 病毒与实践 一、噬菌体与发酵工业 二、昆虫病毒用于生物防治 三、病毒在基因工程中的应用 (一) 噬菌体作为原核生物基因工程的载体
E . coli λ噬菌体：温和噬菌体，线性dsDNA 优点： ① 遗传背景清楚； ② 载有外源基因时，仍可与宿主核染色体整合并同步复制； ③ 宿主范围狭窄，使用安全； ④ 用于其两端各具12个核苷酸组成的粘性末端，故可组成科斯质粒 ⑤ 感染率极高（近100%），比一般质粒载体高出千倍。
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由λ噬菌体构建的载体： （1）凯隆载体（Charon）: 是一种用内切酶改造后所构建成的特殊λ噬菌体载体，在其上可插入小至数 kb (千碱基对)大至 23kb 的外源 DNA 片段； （2）科斯质粒（cosmid）: 是一种由含粘性末端的λ-DNA 和质粒 DNA 组建成的重组体，优点是具有质粒载体和噬菌体载体两者的长处，其本身相对分子质量虽小(6kb)，却可插入各种来源的相对分子质量较大(35-53kb)的外源 DNA 片段，当把它在体外包装成λ噬菌体后，即可高效地感染其 E.coli 宿主，并进行整合、复制和表达。
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(二)动物DNA病毒作为动物基因工程的载体
可作为基因工程载体的动物病毒很多，主要为 SV40(simian virus 40, 即猴病毒 40)，其次为人的腺病毒、牛乳头瘤病毒、 痘苗病毒以及RNA病毒等。SV40是一种寄生在猴细胞中的 DNA病毒，能使实验动物致癌。其生活周期包括引起宿主细胞裂解和转化成癌细胞两个阶段。其 cccDNA(共价闭环DNA) 的相对分子质量为 3×106 。 SV-DNA 是一个复制子，当侵染其宿主细胞后，既能自我复制，也能整合在宿主的染色体组上。若在野生型 SV-DNA 上直接接一外源 DNA ，会因其相对分子质量太大而无法正常包装，故须使用缺失了编码衣壳蛋白后期基因的突变株作载体。为补偿这一功能缺陷，这种突变株还须与其辅助病毒 (helper virus, 如SV-tsA)一起感染，才能在宿主体内正常繁殖。利用这一系统，已将家兔或小鼠的β-珠蛋白或人生激素的基因在猴肾细胞中获得了表达。
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( 三 ) 植物 DNA 病毒作为植物基因工程的载体
因含 DNA 的植物病毒种类较少，故病毒载体在植物基因工程中应用的起步较晚。花椰菜花叶病毒 (CaMV)是一种由昆虫传播的侵染十字花科植物的病毒，含8kb的环状 dsDNA ，存在多种限制性内切酶的切点。在其非必要基因区内插入外源 DNA 后，所形成的重组体仍具侵染性。但由于它不能与宿主核染色体组发生整合，因此还无法获得遗传性稳定的转基因植株。此外，一些真核藻类的 DNA 病毒也有发展前景。
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( 四 ) 昆虫 DNA 病毒作为真核生物基因工程的载体 杆状病毒 (Baculovirus) 在昆虫中具有广泛的宿主，包括鳞翅目、膜翅目、脉翅目、鞘翅目和半翅目等昆虫以及蜘蛛和蜱螨等节肢动物。
病毒体呈杆状，大小 40~60nm×200~400nm, 外有被膜，含 8%~15% 环状 dsDNA 。 它们作为外源基因载体的优点是： ① 具有在宿主细胞内复制的 cccDNA; ② 不侵染脊椎动物，对人畜十分安全； ③ 核型多角体蛋白基因是病毒的非必要基因区，它带有强启动子，可使此基因表达产物达到宿主细胞总蛋白量的 20% 或虫体干重的 10% ；
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④可作为重组病毒的选择性标记，原因是外源 DNA 的插入并不影响病毒的繁殖，却丧失了形成多角体的能力；
⑤对外源基因有很大容量 { 可插入 100kb 的 DNA 片段 } ；⑥有强启动子作病毒的晚期启动子，故任何外源基因产物，甚至对病毒有毒性的产物也不影响病毒的繁殖与传代。 目前，利用杆状病毒作载体已成功地获得了产生人β - 干扰素和α - 干扰素的昆虫细胞株；国内已报道利用重组了毒素基因的杆状病毒作生物防治剂，可使害虫既受病毒侵染又受毒素侵害，双重地杀灭害虫，达到快速 . 高效 . 对人畜无害且不产生抗药性害虫的良好效果。
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小 结
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朊病毒的发病机制 错误折叠 PrPc PrPSc 胁迫 PrPc-PrPSc PrPSc-PrPSc
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