DNA 定序原理與方法 Pi-Chu Hsu Genomics BioSci & Tech.Co., Ltd

Presentation on theme: "DNA 定序原理與方法 Pi-Chu Hsu Genomics BioSci & Tech.Co., Ltd"— Presentation transcript:

1 DNA 定序原理與方法 Pi-Chu Hsu Genomics BioSci & Tech.Co., Ltd
.com.tw

2 DNA 定序法的演進 化學切割法: 1977年由 Maxam 和 Gilbert 所發明 酵素合成法: 1978年由 Sanger 所提出
自動核酸定序法: 1988年 Elder 等人提出

3 Gilbert 與 Sanger 的 DNA 定序方法
Frederick Sanger 1958, 1980 年諾貝爾化學獎 Walter Gilbert 1980 年諾貝爾化學獎 Sanger (英國化學家) 最早測定胰島素的氨基酸順序獲得。22 年後，他因測定了一種噬菌體的一級結構獲 1980 年的諾貝爾化學獎。 Gilbert 在 DNA 定序領域，因其卓越的工作獲得 1980 年諾貝爾化學獎。

4 (1) Maxam-Gilbert 的定序方法 (化學法)：~1977~
先將雙股 DNA 變性分離成單股 DNA，在其 5’ 端以放射線 P32 標示。再以四種化學物質，分別針對特定鹼基進行修飾，並在該鹼基的地方斷裂開，得到一系列長度不同的核酸片段。藥品具毒性且專一性較差。 做為影像顯影的訊號

5 Maxam & Gilbert’s method :
做為影像顯影的訊號

6 (2) Sanger 的定序方法 (生合成法)：~1980~
以 DNA 聚合酶進行長鏈合成的反應，將四種核苷酸的類似物 (ddNTP) 在適當時間分別加入四個進行中的 DNA 合成反應中，當 DNA 合成以此為材料時，DNA 長鏈的合成隨即中止，由於每個位置都有機會停止，會產生各種長度的 DNA，由此即可排列出 DNA 序列 做為影像顯影的訊號

7

8 (2) Sanger 的定序方法 (生合成法)：~1980~
Analog Sanger 方法在技術上比較容易也較為廣泛的應用。此方法需要 DNA 聚合酶、引子(primer)、dNTP (dATP* or dCTP*)、ddNTP (analog)、模板股 DNA (template)。

9 phosphodiester linkage

10 (2) Sanger 的定序方法 (生合成法)：~1980~

11 (2) Sanger 的定序方法 (生合成法)：~1980~

12 5‘ 3‘ 放射性標定的 dNTP 3‘ 3‘ ACTGACTG ACTGACTG 5‘ 5‘

13 (3) 自動核酸定序 (autosequencing) :
由 Sanger 方法不斷改良： (1) 使用螢光染劑取代放射線物質標定 (2) 同時加入四種不同螢光標定的 ddNTP，終止反應 (3) 每個樣品只需一條電泳即可，由電腦判讀結果 (傳統為 ATCG 四條電泳分開) (4) 毛細管電泳取代傳統平板膠電泳 ABI PRISM 3730xl DNA Analyzer

14 (3) 自動核酸定序 (autosequencing) :
特點： (1) 靈敏度高：利用 PCR 原理，以耐熱 DNA 聚 合酶進行 DNA 定序，可增強訊號。 (2) 適合大量操作：每一樣品只需跑一條電泳。 每批反應的樣品數量至少可增加四倍。 (3) 快速得到結果：反應後直接利用電腦判讀結 果，節省人工判讀時間並增加準確性。1 小 時可得到 96 個檢體定序結果，偵測長度也 大幅提升到 bp。

15 A, T, G, C 電腦判讀 人工判讀 自動定序是採用 Sanger 的原理，同時加入四種不同螢光的 ddNTP 中止反應，每個樣本只需進行一條電泳即可。

16 (3) 自動核酸定序 (autosequencing) :

17 (3) 自動核酸定序 (autosequencing) :

18 Autosequence data (1) ab1. (2) txt.

19 Cycle sequencing reaction
(ABI PRISM Big Dye v3.1 cycle sequencing ready reaction kit ) Dye-labeled terminators Template (PCR product ,ds-DNA ,ss-DNA.. ) Primer AmpliTaq DNA Polymerase BigDye Terminators Others (buffer , Mg2+ ,dNTP)

20 ABI PRISM 3730xl DNA Analyzer
特點: 48 根毛細管 自動取樣品，每次可跑 48 個樣品，需要花費兩個小時。 5*96 = 480 (overloding/day)

21 DNA 定序應用: 基礎研究: 基因結構，基因功能 基因體研究: 生命的起源 人種或物種之差異 特定基因變異與疾病 檢驗試劑及新藥開發

22 Thanks for your attention!!