生物标志物与分子流行病学 吕嘉春 广州医学院.

Presentation on theme: "生物标志物与分子流行病学 吕嘉春 广州医学院."— Presentation transcript:

1 生物标志物与分子流行病学 吕嘉春 广州医学院

2 学习目标 掌握生物学标志物的概念 掌握生物学标志物的分类 理解生物学标志物的用途 理解在流行病学研究中使用生物学标志物应注意的问题
下面是几种参考文献 1. Vainio H. Use of biomarkers--new frontier in occupational toxicology and epidemiology. Toxicol Lett 1998; :58-9. 2. Boffeta P. Source of bias, effect of confounding in the application of biomarkers to epidemiological studies. Toxicol Lett 1995;77:235-8. 3.

3 操作目标 在设计应用生物学标志物的流行病学研究时能够做到合理选择标志物 阅读应用生物学标志物的文献时能够分析其合理性

4 什么是生物标志物 生物标志物是从生物学介质中可以检测到的细胞、生物化学或分子改变。
生物学介质包括各种体液（如血液、尿液）、粪便、组织、细胞、头发、呼气等。 生物学标志物英文为biomarker，是biological markers或biochemical marker的缩写。 还有人将生物学标志物定义为：存在于生物系统（如人体）或生物标本内的暴露物质、暴露剂量、机体反应或机体易感性的指示物。 除所列出的几种生物学介质以外，还有使用指甲、儿童脱落牙齿、乳汁、精液、唾液、手术切割组织、口腔粘膜细胞、尿液脱落细胞的研究例子。

5 为什么要用生物标志物 暴露测量：精确 研究对象选择：减少错分 机体反应：提前发现 个体易感性： 暴露 健康损害：有助于阐明机理
暴露 健康损害：有助于阐明机理 流行病学研究的本质涉及到对暴露和机体反应的测量。传统流行病学研究对暴露的测量大多采用问卷的形式。因而象回忆偏倚等往往难于避免。另外，如暴露随时间变动，或多途径暴露，复合暴露等，用传统的问卷调查难于解决。而采用生物学标志物则可解决这些问题。 传统流行病学方法往往只有在损害到达相当程度时才能鉴别出，而采用生物学标志物则可将可观察的终点前移，既可增加队列研究终点人数，又可提前发现机体损害，也有利于研究低暴露的影响。 传统流行病学常常观察到同等暴露个体之间的发病危险差异，但难于解释， 总之，在流行病学研究中合理采用生物学标志物有助于揭示流行病学的黑匣子。

6 从暴露到发病的途径 个体易感性 暴露 疾病 内部 剂量 生物学 有效剂量 机体结构/机能改变 早期 反应
环境暴露（其量称为外部剂量）进入机体，进入的多少为内部剂量，内部剂量中的一部分同靶器官、靶组织、或靶分子结合，发挥作用，并造成损害，其量的多少称为生物学有效剂量。如机体对损害尚未超过机体的修复能力时，则表现为一些指标的改变，但仍在正常范围内或处于临界状态；如超出机体的代偿能力，则表现功能或结构的异常，在进一步发展，则表现为临床期疾病。

7 生物标志物的分类 暴露标志物 易感性标志物 效应标志物：机体早期反应与疾病标志 内部剂量标志物 生物学有效剂量标志物
内部剂量标志物是进入机体的暴露物质本身、其代谢产物、或与机体相互作用产生的物质。 生物学有效剂量是与生物大分子（如DNA，蛋白质）结合的暴露物质的数量。 易感性标志物是由遗传决定或后天获得的某种状态。 有些标志物既可作为暴露标志物，又可作为机体反应标志物。

8 内部剂量标志物 内部剂量标志物是在生物材料中测得的暴露物质或暴露物质的代谢产物。
内部剂量的例子是很多的。能够称为内部剂量标志物的最重要条件是，它应和外部剂量又很好的相关性。同时又能比外部剂量更好的反映机体的暴露负荷。

9 生物学有效剂量标志物 与重要的亚细胞靶结构相互作用的暴露物质剂量即生物学有效剂量。
目前研究最多的是化学物质与DNA形成的加合物。一般认为，与DNA形成加合物是致癌物质发挥作用的前提条件。除DNA加合物外，还有研究化学物质与血浆白蛋白或血红蛋白加合物的研究报道。 可研究外部剂量或内部剂量与加合物的关系，此时，加合物为因变量；也可研究加合物与疾病发生的关系，此时，加合物为自变量。 有人将加合物作为早期生物学反映标志物。

10 易感性标志物 可测得的遗传或获得性因素的指示物。易感性本身不引起疾病，但可影响暴露引发疾病的概率。
遗传性机体易感性主要表现在酶的多态性、DNA修复能力差异上。 获得性机体易感性主要表现在营养状态上。如某些营养素对体内的酶类或某些毒物的代谢有关系。

11 生物学反应标志物 因对暴露反应而引起的靶细胞或组织的生物学改变
有些生物学反应标志物与暴露物之间缺乏特异关系。象染色体改变，基因改变等；另外一些则有较强的特异性，如原卟啉升高表明铅中毒，乙酰胆碱脂酶活性降低提示有机磷农药中毒。当然，还要结合暴露史。

12 疾病标志物 疾病标志物是一生物学或生物化学事件的指示物，它预示着疾病的亚临床期或是疾病自身的一种表现
疾病标志物也属生物学反应标志物。几乎每种疾病都有某种标志物，但这些标志物有一个共同特点，就是特异性较低。

13 流行病学研究中常用的 几种生物标志物 暴露物质本身或其体内代谢产物 染色体改变：如染色体畸变、姊妹染色单体交换、微核等
DNA加合物、蛋白质加合物 各种酶类 基因与癌基因 暴露物质本身或其代谢产物用作内部暴露剂量。工业卫生中的生物学监测就是对机体内暴露物质本身或其代谢产物的测定。 染色体改变可视为早期生物学反应标志物。该类标志物对暴露物质缺乏特异性，但可反应机体总的致癌、致突变物质暴露负荷。 DNA、蛋白质加合物可视为生物学有效剂量标志物。 多种酶可作为机体易感性标志物：如N-乙酰转移酶、芳香烃羟化酶、P-450、等。 基因与癌基因作为机体易感性标志物，如P53基因，ras基因等。

14 暴露剂量生物学标志物的用途 估计总的健康危害 综合反映多途径暴露 综合反映飘忽不定的暴露 将暴露发生时间同内部剂量联系起来
研究急性暴露与健康结局之间的联系 研究长期暴露与健康结局之间的联系 从混合暴露物中区分出致病性物质 增加对发病机制的认识 估计总的健康危害 当某种暴露可经一种以上的途径进入人体时；当暴露剂量随时间变动而变化时，通过测量外部剂量来估计暴露剂量就比较困难。此时，可通过测定内部剂量标志物来做到；通过测定对头发、指甲或牙齿中某种暴露物质（多为重金属）的测定，来估计发生暴露的时间；在急性暴露与健康结局时，生物学标志物可用于估计暴露剂量；如能暴露长时期变化不大，亦可用现实生物学标志物作为既往暴露的替代物，研究与健康结局之间的关系；暴露剂量标志物还有助于从混合化学暴露物质中鉴别助致病性物质。

15 易感性生物学标志物的用途 估计个体发病危险性 增加对暴露-疾病联系强度估计的精确性 提供发病机理的线索 目前研究热点：
代谢酶、受体、DNA修复酶 基因的多态性与人群的肿瘤易感性研究。 传统流行病学研究虽然对一些有可能影响个体发病概率的因素，如年龄，性别等有所注意（如分层分析等），但对这些层内个体的易感性却不加区分，这样暴露与疾病之间的联系强度会因存在一部分不易感个体而受到“稀释”。如能去除这一部分不易感者，对暴露-疾病之间联系的估计会更精确。

16 早期生物学反应和疾病生物标志物的用途 有助于早期发现健康损害 在建立队列时，将亚临床期疾病病人排除 改进对疾病诱导期、潜伏期的估计
确定暴露发生作用的疾病发展阶段 使疾病的分类更为合理 建立队列时，借助早期生物学标志物，可将处于亚临床期的个体排除；采用早期生物学反应标志物还可以比较精确地估计从暴露到病理改变出现这段诱导期，以及从病理改变到临床症状出现这段潜伏期。疾病标志物还可使疾病分类更为合理。用不同疾病发展阶段标志物可以研究每个阶段发生作用的危险因素。

17 例1、用TNT-Hb加合物估计TNT的暴露剂量
暴露剂量因工种、时间而异 传统对暴露的测定方法：环境TNT粉尘浓度，对经消化道和皮肤吸收难以估计 生物检测：血、尿中TNT代谢物测定：反映近期暴露 TNT是制造制造民用炸药的原料，在矿山开采业广泛应用。TNT可引起肝脏、眼晶状体等多种损害。TNT可经多种途径进入人体。通常靠测定工作场所空气中TNT浓度来或尿液中TNT代谢产物来检测工人暴露量。显然用空气中TNT浓度来估计暴露量很不准确，因为TNT还可经其它途径吸收。对血尿中TNT代谢产物的测定日间变动较大，除非连续检测，否则难于反应一段时间的平均暴露量。

18 TNT从各种途径吸收进入血液以后，部分与血红蛋白结合，形成TNT-Hb加合物
TNT-Hb加合物与传统的暴露剂量指标、工种、TNT晶状体白内障有无等相关，表明这加合物能够真实反映暴露水平 TNT-Hb加合物相对稳定(3个月内) TNT-Hb反映了多途径总的暴露剂量 研究发现，TNT经各种途径吸收入血以后，部分与血红蛋白（Hb）结合，形成TNT-Hb加合物。该加合物与外部剂量有很好的相关性，并且相对稳定，可以反应近3个月的暴露水平。检测方法也不十分复杂。因而适宜在流行病学调查中使用。

19 例2、黄曲霉毒素与肝癌关系研究 以往多次流行病学调查表明，食用霉变食物增加肝癌发生的危险性
食物中的黄曲霉毒素含量因季节、地区、因素习惯不同而不同 对个体黄曲霉毒素的摄入量估计困难 缺乏黄曲霉致病的直接证据 生态学研究、横断面流行病学研究、病例对照研究均表明，使用霉变食物与肝癌的发病危险有关，也从肝癌高发区粮食中检测到了含量较高的黄曲霉毒素。但尚缺乏来自人体黄曲霉毒素暴露的直接证据。

20 队列内病例对照研究：18,000份45-64岁健康男性尿液标本，随访7年，50人发生肝癌。
尿中黄曲霉毒素阳性发生肝癌的危险度RR为3，乙肝表面抗原阳性的危险度RR为7，两者均阳性的危险度为60。可见两种危险因素的作用间有相乘作用。 这是应用暴露生物学标志物的一个很好的例子，感兴趣的读者可以查阅原文（Qian G-S, et al. Urinary markers of aflatoxin exposure and liver cancer risk in Shanghai, P.R.C. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1994;3:3-11. Ross R, et al. Urinary aflatoxin biomarkers and risk of hepatocellular carcinoma. Lancet 1992;339:

21 生物标志物的选择 关联性：所选用的生物学标志物应与所研究的暴露-疾病关系有关联 真实性：所选用的暴露标志物应能反映暴露有无及其剂量
可靠性：即可重复性 稳定性：所选用的标志物应相对稳定 由于许多生物学标志物的本质尚未完全明了，所使用的生物学标志物能否反映暴露、早期生物学反应、或是个体易感性应是最重要的问题；用于代表机体暴露剂量的内部剂量标志物或生物学有效剂量标志物应与外部暴露剂量有很好的相关性；标志物的测定方法应有很好的可重复性；所选用的标志物应相对稳定。

22 应用生物学标志物应注意的问题 个体间变异：不同个体同一组织器官中标志物的出现频率和量有可能相差很大
组织间变异：同一个体不同组织器官之间标志物出现的频率和量可能差别较大 测定方法；不同测定方法的灵敏度不同 样本含量：由于测定方法的复杂性或费用问题，样本含量一般较小，因此统计把握度较低 有资料表明，某些生物学标志物个体间存在较大差异。有研究报道，吸烟量相似的个体间，与DNA结合的苯并芘数量可相差100倍。不同组织器官间同一标志物的出现频率和含量可能相差很大；有些生物学标志物可能有多种测定方法，不同方法的灵敏度和测定值是不相同的。由于应用生物学标志物的流行病学研究样本含量均不会很大，因此，比较组之间可能检测不出统计学差异。

23 流行病学研究设计特点 横断面研究：应用生物学标志物的流行病学研究大多具有横断面的特点 病例-对照研究：实质上也为横断面
病例-病例研究：将某种疾病病例按标志物有无分为两组，比较两组间某些因素的差异 队列内（巢式）病例-对照研究：需要在队列建立时采取并储存生物标本，如血清 如果在研究的当时测定生物学标志物，并分析其与暴露或机体反应的关系，这种研究均具有横断面流行病学研究的特点。当然也可以进行前瞻性研究，这需要相当的费用，也需要较长的随访时间。如以前建立的一个队列保存有适宜标本，则可进行队列内病例对照研究（nested case-control study）。这在研究胃幽门螺杆菌与胃癌关系时得到了很好的应用。

24 应用生物学标志物的优点 暴露标志物 易感性标志物 生物学反应标志物 对暴露的测定更精确 减少暴露错分 可筛检出易感个体 估计个体危险性
可发现早期反应 有助于揭示暴露致病机理 应用生物标志物的优点是显而易见的。主要表现在对暴露和机体反应的精确定量测定上。在病因研究中，通过易感性标志物的测定，将不易感个体排除，从而得到真实的危险度估计。另外，生物学标志物的应用有助于揭示暴露致病机理。

25 应用生物学标志物的缺点 有些标志物测定方法复杂、费用昂贵 无法对久远的暴露进行测量 不宜对随时间变动较大的暴露进行测量
样本量一般较小，研究的把握度较小 不易控制多个因素的混杂作用 许多标志物的本质尚不完全明了 同任何方法或技术一样，生物学标志物在应用上也存在一些问题。有些可随时间的推移而得到改进，有些则为固有的缺陷。由于生物系统内的代谢作用，如没有事先保存生物标本的话，对很久以前的暴露无法用生物标志物进行精确的测定。另外，目前对一些生物标志物的本质以及在从暴露至发病过程中所起的作用尚未完全了解。

26 生物标志物 小结 合理选用生物学标志物会增强流行病学在探索暴露-疾病之间关系方面的能力
不加选择地使用生物学标志物并不能提高流行病学研究的质量 传统方式的流行病学调查仍会继续应用 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

27 分子流行病学 定义：利用现代分子生物学原理和技术， 从分子乃至基因水平阐明疾病和健康状态的相关生物标志物（或分子事件）在人群中的分布及其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略与措施的科学。 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

28 传统流行病学与分子流行病学 传统流行病学： 暴露 疾病 以分布为基础，进行病因推断。
暴露 疾病 以分布为基础，进行病因推断。 流行病学研究的本质涉及到对暴露和机体反应的测量。传统流行病学研究对暴露的测量大多采用问卷的形式。因而象回忆偏倚等往往难于避免。另外，如暴露随时间变动，或多途径暴露，复合暴露等，用传统的问卷调查难于解决。而采用生物学标志物则可解决这些问题。 传统流行病学方法往往只有在损害到达相当程度时才能鉴别出，而采用生物学标志物则可将可观察的终点前移，既可增加队列研究终点人数，又可提前发现机体损害，也有利于研究低暴露的影响。 传统流行病学常常观察到同等暴露个体之间的发病危险差异，但难于解释， 总之，在流行病学研究中合理采用生物学标志物有助于揭示流行病学的黑匣子。

29 分子流行病学的切入点 -------暴露标志-------- ---效应标志--- 易感标志物 暴露 疾病 内部 剂量 生物学 有效剂量
早期 反应 机体结构/机能改变 疾病 易感标志物 环境暴露（其量称为外部剂量）进入机体，进入的多少为内部剂量，内部剂量中的一部分同靶器官、靶组织、或靶分子结合，发挥作用，并造成损害，其量的多少称为生物学有效剂量。如机体对损害尚未超过机体的修复能力时，则表现为一些指标的改变，但仍在正常范围内或处于临界状态；如超出机体的代偿能力，则表现功能或结构的异常，在进一步发展，则表现为临床期疾病。 暴露标志 ---效应标志---

30 生物标志物的种类 1、暴露标志 2、易感标志 3、效应标志
在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

31 如何进行工作？ 1、标志物的筛选： 能反映疾病的进程； 特异性高、稳定性好； 检测方法灵敏、特异、快速方便。
2、标本采集与储存：无污染；不变质；标本档案材料要齐全。 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

32 （2）RNA水平：RT-PCR、Northern Blot （3）蛋白质水平：Western Blot、组化 （4）功能水平：酶学、机能学
3、检测技术要合适。 （1） DNA水平：PCR、SSCP、测序 （2）RNA水平：RT-PCR、Northern Blot （3）蛋白质水平：Western Blot、组化 （4）功能水平：酶学、机能学 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

33 4、设计方案的要求： （1）与流行病学研究方法一致。 （2）样本种类和样本量的确定。 （3）检测指标的选择：要有理论依据；
考虑到纵向和横向对比。 （4）强调多学科的合作。 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

34 分子流行病学主要研究方法 一、选择生物标志物作为测量指标 “暴露---易感----效应” 三大类 要求：（1）. 特异、稳定
“暴露---易感----效应” 三大类 要求：（1）. 特异、稳定 （2）.标本采集、储存方便 （3）.检测方法简便、实用、规范 （4）.灵敏度和特异度高 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

35 二、标本收集与储存 建立与检测技术相适应的生物标本库。 要求:（1）.无污染。 （2）.每个标本都有标识和病例背景。
（3）.储存标本在有效期内结果稳定。 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

36 1、DNA: Southern blot; PCR; Sequencing.
三、常用分子生物学及相关技术 简介 1、DNA: Southern blot; PCR; Sequencing. Enzyme restriction; electrophoresis. 2、RNA: Northern blot; Dot blot; RT-PCR. 3、Protein: Western blot; Immuno-histochemistry. 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

37 四、资料分析： 1、传统流行病学指标。 2、遗传学多态性、杂合度等。 3、连锁与分离分析。 4、易感性与危险度分析。
在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

38 五、质量控制 1、仪器设备的计量校正、正确使用。 2、实验试剂的批次不变。 3、标本采集和储存能确保其生物性状。
4、实验方法统一，操作规范。 5、设立多重对照：标准、空白、+、-。 6、重复试验。 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

39 某地1名牙医（HIV+）与7名HIV感染者(该牙医治疗过的病人)有无传播关系？
六、研究实例 1、应用PCR和测序追踪HIV传染源。 某地1名牙医（HIV+）与7名HIV感染者(该牙医治疗过的病人)有无传播关系？ 同时抽查35名与该牙医无关的HIV感染，取外周血分离单核细胞，经PCR、测序；结果：牙医HIV株与5名其治疗过的病人的HIV同株,其它毒株与牙医株关系较远。 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

40 2、GSTm1基因多态与潮汕地区食管癌易感性的关系。 107例食管癌，111例正常人，外周血提取DNA，进行PCR扩增。无产物为“-”。
GSTm1 case control 合计 X2= 4.34, P=0.0371, OR=1.78 (1.01,3.07) 在流行病学研究中合理地使用生物学标志物会促进流行病学的发展。但并非所有的流行病学研究都适用生物学标志物。如何做到合理使用是生物学标志物流行病学研究成功的关键。

41 研究实例 1 研究题目 波兰某工业区环境中芳香族化合物暴露人群的DNA加合物研究 测量指标 DNA加合物/淋巴细胞DNA（介质） 测量方法
第三节 研究方法 研究实例 1 研究题目 波兰某工业区环境中芳香族化合物暴露人群的DNA加合物研究 测量指标 DNA加合物/淋巴细胞DNA（介质） 测量方法 荧光检测竞争ELISA法、DNA加合物32P后标记技术 研究设计 横断面分析研究 暴露组 煤焦油作业工人 对照组 当地城市居民、近郊农民 排除年龄、吸烟、其他职业暴露等因素影响 比较3组DNA加合物水平

42 结果分析 质量控制 当地城市居民（19例）与煤焦沥青作业工人（63例）的DNA加合物水平和谱型相似
第三节 研究方法 结果分析 当地城市居民（19例）与煤焦沥青作业工人（63例）的DNA加合物水平和谱型相似 近郊农民（15例）的DNA加合物水平仅为煤焦油作业工人的1/2或1/3 结论 环境中芳香族化合物（煤焦油）暴露可导致体内DNA加合物水平 质量控制 每份标本同时在不同实验室检测 结果一致性好(r=0.66, p<0.01)

43 研究实例 2 研究题目 应用HBV-DNA序列多态性研究HBV的传播 测量标志 HBV 2551-2650位点核酸序列/血清HBV-DNA
第三节 研究方法 研究实例 2 研究题目 应用HBV-DNA序列多态性研究HBV的传播 测量标志 HBV 位点核酸序列/血清HBV-DNA 测量方法 ELISA法和PCR法 研究设计 类病例对照研究（病例病例研究） 96名HBeAg阳性儿童和用ELISA检测HBV血清阳性的97名父母 假设该位点核酸序列在儿童与父母之间分配是随机的 结果分析 该序列在儿童和父母之间是非随机分配的（P< ) 结论 HBV具有家庭内传播 质量控制 关于家庭成员之间1%的序列差异的解释 排除了PCR错配可能

44 返回主菜单