微生物指标检测准备工作 主讲：高锦洪 云南省曲靖农业学校

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1 微生物指标检测准备工作 主讲：高锦洪 云南省曲靖农业学校 2015.05.15
曲靖市食品生产企业检测人员培训 微生物指标检测准备工作 主讲：高锦洪 云南省曲靖农业学校

2 培训内容 微生物基础知识 微生物检测准备工作

3 微生物基础知识 一、微生物的概念、特点 概念
微生物（microorganism, microbe）是一些肉眼看不见的微小生物的总称。包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌（过去称蓝藻或蓝绿藻），属于真核类的真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等。　　

4 概念 微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可有含有50 亿个细菌。

5 食品微生物： 细菌、霉菌、酵母菌、放线菌、病毒、噬菌体

6 微生物特点 1．体积小、比表面积大 微生物的大小以μm计，但比表面积（表面积/体积）大，必然有一个巨大的营养吸收，代谢废物排泄和环境信息接受面。这一特点也是微生物与一切大型生物相区别的关键所在。 举例：乳酸杆菌：120，000；鸡蛋：1.5；人（200磅）：0.3

7 微生物特点 2．吸收多、转化快 这一特性为高速生长繁殖和产生大量代谢物提供了充分的物质基础。
举例：3克地鼠每天消耗与体重等重的粮食；1克闪绿蜂鸟每天消耗两倍于体重的粮食；大肠杆菌每小时消耗2000倍于体重的糖；发酵乳糖的细菌在1小时内就可以分解相当于其自身重量1,000~10,000倍的乳糖，产生乳酸；1公斤酵母菌体，在一天内可发酵几千公斤的糖，生成酒精

8 微生物特点 3．生长旺、繁殖快 极高生长繁殖速度，如：E.coli（大肠杆菌）20-30分钟分裂一次，这一特性可在短时间内把大量基质转化为有用产品，缩短科研周期。也有不利一面，如疾病、粮食霉变。举例：大肠杆菌在最适的生长条件下，每12.5~20分钟细胞就能分裂一次；在液体培养基中，细菌细胞的浓度一般为108~109个/ml；谷氨酸短杆菌：摇瓶种子→50吨发酵罐：52小时内细胞数目可增加32亿倍。利用微生物的这一特性就可以实现发酵工业的短周期、高效率生产。例如生产鲜酵母时，几乎12小时就可以收获一次，每年可以收获数百次。

9 微生物特点 4、适应强、易变异 极其灵活适应性，对极端环境具有惊人的适应力，遗传物质易变异。更重要的是在于微生物的生理代谢类型多、代谢产物种类多。举例：万米深海、85公里高空、地层下128米和427米沉积岩中都发现有微生物存在。

10 微生物特点 5．分布广、种类多 分布区域广，分布环境广。生理代谢类型多，代谢产物种类多，种数多。更重要的是在于微生物的生理代谢类型多、代谢产物种类多。任何有其它生物生存的环境中，都能找到微生物，而在其它生物不可能生存的极端环境中也有微生物存在。 举例：青霉素生产菌（产黄青霉）的产量1943年为每毫升发酵液中含20单位青霉素，40多年来，经过世界各国微生物遗传育种工作者的不懈努力使该菌产量变异逐渐积累，加上发酵条件的改进，世界上先进国家的发酵水平每毫升已超过5万单位，甚至接近10万单位。

11 微生物特点 ⒍易于变异，产生突变 微生物个体小，比表面积大等原因，使得微生物容易受环境条件的影响，在紫外线、生物诱变剂以及环境中的某些营养因子的改变，微生物个体自觉和被迫产生基因结构改变，从而产生变异体，据统计自然条件下，微生物个体变异概率为百万分之一。

12 二、如何理解食品生产中的有益菌和有害菌 微生物都是有害的？ 1、针对人 有益菌：对人体有益的微生物 乳酸菌
有益菌：对人体有益的微生物 乳酸菌 有害菌：对人体有害的微生物 大肠杆菌 致病菌：引起人体得病的微生物 金黄色葡萄球菌

13 2、针对食品生产 除自然发酵食品外，微生物对食品生产都是有害的。 微生物可以用来食品生产？ 所有微生物都可以用来生产食品？ 所有食品都可以有有益菌存在？ 所有食品都不能有微生物存在？

14 三、微生物与食品生产的关系 1、微生物知识是食品加工理论来源的主要基础 加热 浓缩 干燥 糖制 2、微生物引起食品腐败变质的机理
加热 浓缩 干燥 糖制 2、微生物引起食品腐败变质的机理 微生物产生酶（主要是分解酶）

15 四、影响微生物生长的主要因素（食品腐败变质的主要因素）
温度

16 水分活度 大多数食品的腐败变质主要是由微生物的作用引起的，而微生物的生长与繁殖必须有充足的水分，因为微生物从外界摄取营养物质并向外界排泄代谢物质都需要水作为溶剂或媒介。但是除去食品中大部分的水分并不能阻止微生物的生长，故水分含量不是表示体系中微生物能否生长繁殖的最佳指标，食品所含的水分有结合水分和游离（或自由）水分，但只有游离水分才能被微生物、酶和化学反应所能利用，此即有效水分，可用水分活度（Aw）加以估量。控制有效水分，能抑制微生物的生长活动，使食品保藏时间延长。

17 水分活度 对食品中有关微生物需要的水分活度进行大量研究的结果表明，各种微生物都有它自己生长最旺盛的适宜水分活度。水分活度下降，它们的生长率也下降。各种微生物保持生长所需的最低Aw值各不相同。大多数最重要的食品腐败细菌所需的最低Aw值都在0.90以上，但是肉毒杆菌则在水分活度低于0.95时就不能生长

18 微生物实验室通常包括实验室和无菌室，无菌室包括了其外面缓冲间。
五、无菌操作 1.无菌实验室 微生物实验室通常包括实验室和无菌室，无菌室包括了其外面缓冲间。

19 无菌室内墙壁光滑，应尽量避免死角，以便于洗刷消毒。 应保持密闭、防尘、洁净、干燥。进行操作时尽量避免走动。 室内设备简单，禁止放置杂物。
五、无菌操作 2.无菌室的要求： 无菌室内墙壁光滑，应尽量避免死角，以便于洗刷消毒。 应保持密闭、防尘、洁净、干燥。进行操作时尽量避免走动。 室内设备简单，禁止放置杂物。 工作台、地面和墙壁可以用过氧乙酸溶液擦洗消毒。

20 杀菌前做好一切准备工作，然后用紫外线杀菌灯进行空气消毒；开灯照射30min后关灯，间隔30min后方可进入。
五、无菌操作 杀菌前做好一切准备工作，然后用紫外线杀菌灯进行空气消毒；开灯照射30min后关灯，间隔30min后方可进入。 无菌室内间隔一定时间用2mL/m3甲醛溶液或20mL/m3丙二醇溶液熏蒸消毒。 无菌室的大小应按操作人员占用面积不少于3平方米设置。

21 五、无菌操作 3.无菌室无菌程度的检测： 测定无菌室无菌程度一般采用平板法，将以灭菌的营养琼脂培养基分别倒入已灭过菌的培养皿内，每皿15mL培养基，启开皿盖暴露于无菌室内的不同地方10min后盖好盖，将平皿到置于37℃培养24h后观察统计菌落数；如果每个皿中菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好。

22 培养箱：取放物品应快速进行，并随手关闭箱门以维持恒温；要定期断电消毒，先用3%来苏水溶液涂布消毒，再用清水抹去擦净。
五、无菌操作 4.常用仪器使用注意事项： 培养箱：取放物品应快速进行，并随手关闭箱门以维持恒温；要定期断电消毒，先用3%来苏水溶液涂布消毒，再用清水抹去擦净。 超净工作台：使用前30min，要打开紫外灯，对工作区域进行照射杀菌，然后开启通风，用酒精面或纱布擦试台面；操作者应穿着洁净工作服、工作鞋、最好戴口罩。

23 五、无菌操作 4.常用仪器使用注意事项： 干燥箱：灭菌完毕不能立即打开箱门，要关闭电源待温度自动降至50℃以下再开门取物，否则玻璃器材有可能剧冷而爆裂；如事先将器皿用纸包裹或带有棉塞，则灭菌后在适宜环境可保持无菌状态达一周。

24 高压灭菌锅：使用前检查水位；打开排气阀加热，保持大量蒸汽排除后5min在关闭排气阀；灭菌后要在压力自然下降至0时方可打开。
五、无菌操作 4.常用仪器使用注意事项： 高压灭菌锅：使用前检查水位；打开排气阀加热，保持大量蒸汽排除后5min在关闭排气阀；灭菌后要在压力自然下降至0时方可打开。 温度和灭菌效果的检验： 温度可用一只

25 灭菌：杀灭物体中或物体上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）的繁殖体和鲍亚的过程称为灭菌。
五、无菌操作 5.基本概念 灭菌：杀灭物体中或物体上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）的繁殖体和鲍亚的过程称为灭菌。 消毒：用物理的、化学的或生物的方法杀死病原微生物的过程称为消毒。（具有消毒作用的物质称为消毒剂，一般消毒及在常用浓度下，只对细菌的繁殖体有效，对于细菌芽孢则无杀灭作用）

26 防腐：防止或抑制微生物生长繁殖的方法称为防腐。用于防腐的药物称为防腐剂。某些药物在低浓度时为防腐剂，在高浓度时则为消毒剂。
五、无菌操作 防腐：防止或抑制微生物生长繁殖的方法称为防腐。用于防腐的药物称为防腐剂。某些药物在低浓度时为防腐剂，在高浓度时则为消毒剂。 无菌：无菌是不含活的微生物的意思。防止微生物进入机体或物体的方法叫无菌技术或无菌操作。进行微生学实验操作时，必须严格注意无菌操作。

27 注意：开干燥箱的门时一定要等至温度降至室温后，防止包装纸自燃。
五、无菌操作 6.物理灭菌的方法： 干热灭菌法：通过使用干热空气杀灭微生物的方法。一般是将待灭菌物品包装后放入干燥箱，加热至160℃维持2h。常用于玻璃仪器、金属器具的灭菌，凡带有橡胶的物品、液体及固体培养基等都不能使用此法 注意：开干燥箱的门时一定要等至温度降至室温后，防止包装纸自燃。

28 7.过滤除菌法： 8.紫外线杀菌法： 9.化学灭菌法： 6.物理灭菌的方法： 湿热灭菌法：常用的培养基灭菌，有在 115℃，也有在121℃。
五、无菌操作 6.物理灭菌的方法： 湿热灭菌法：常用的培养基灭菌，有在 115℃，也有在121℃。 7.过滤除菌法： 8.紫外线杀菌法： 9.化学灭菌法：

29 一、卫生指标 微生物指标检测准备工作介绍 1、菌落总数测定 个/ml(克) 2、大肠菌群测定 个/100ml(100克)
3、致病菌检测 不得检出

30 一、卫生指标 GB10132-2005 鱼糜制品卫生标准 GB10133-2005 水产调味品卫生标准 GB10136-2005
腌制生食动物性水产品,卫生标准 GB 盐渍鱼卫生标准 GB 动物性水产干制品卫生标准 GB 食用动物油脂卫生标准 GB 食品安全国家标准,婴儿配方食品 GB 食品安全国家标准,较大婴儿和幼儿配方食品 GB 食品安全国家标准,婴幼儿谷类辅助食品 GB 食品安全国家标准,婴幼儿罐装辅助食品

31 二、出厂检验 产品类别 检验项目 糕点 白酒 外观和感官、净含量、水分或干燥失重、馅料含量、细菌总数、大肠菌群 1、糕点类
2、酒类 产品类别 检验项目 糕点 外观和感官、净含量、水分或干燥失重、馅料含量、细菌总数、大肠菌群 白酒 感官、酒精度、总酸、总酯、固形物、甲醇、杂醇油、单体物质、净含量

32 三、检测前的准备 1、实验室的准备 无菌室 2、设备、用具准备 超菌操作台 无菌培养皿 无菌吸管 无菌稀释液 酒精
1、实验室的准备 无菌室 2、设备、用具准备 超菌操作台 无菌培养皿 无菌吸管 无菌稀释液 酒精 3、培养基的准备 营养琼脂 MRS 4、稀释液的准备 ml ml 5、样品准备 液体 固体

33 微生物实验室管理 超 净 工 作 台 100 级

34 微生物实验室管理 严格区分污染区及清洁区

35 2 仪器设备 高压灭菌锅 显微镜 干热灭菌锅 其他 培养箱 灭菌物品不宜过多 注意防尘、清洁 压力降至零再开锅 使用油镜后擦拭
器皿和内层底板不能直接接触压力降至零再 开锅 装有纸包装的物品灭菌温度不能超过160℃ 培养箱 每天记录温度和湿度 随手关门维持恒温 培养物不宜与培养箱最底层直接接触 显微镜 注意防尘、清洁 使用油镜后擦拭 其他 不同物品采用正确的灭菌方式 已灭菌和为未灭菌用品应分开，且有明显标识

36 湿热灭菌仪器 圆型压力蒸汽灭菌器 全自动压力蒸汽灭菌器

37 3 培养基和试剂 培养基的制备和质量控制按照GB/T 4789.28执行 培养基配置注意要点 培养基必须由专业厂家、质量必须符合有关质量标准
干粉培养基防止潮解、结块 培养基配置注意要点 培养基配制过程主要为配制、溶解、矫正PH值、过滤澄清、分装及高压 培养基的配制必须在玻璃容器、搪瓷缸中进行，不能用铜铁器皿 分装培养基一般不超过容器的2/3；分装为试管容量1/5，斜面长度约为试管的2/3； 新制成的平皿放置在37℃待平板表面干燥后再使用；

38 4 采样 5 样品的接受和预处理 所用接触样品的用具经过灭菌 取样要均匀、特殊样品要控制温度
冷冻食品应保持在冷冻状态直到检验；化冻时必须小心放置于细菌生长温度之下以免细菌数量增加 冷藏样品应尽快放在冷藏温度下解冻，亦可放在适宜温度下（37℃）下短时间（15min）使其解冻；

39 四、菌落总数测定 1菌落的定义： 2菌落总数： （一）概念 将细菌划线接种在固体培养基上经48∽72小时培养，长出肉眼可见
有单一细菌生长繁殖而成的细菌集团。 2菌落总数： 食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1ml（g）检样中形成 的微生物菌落的总数。

40 （二）菌落总数的检验程序

41 二.菌落总数的检验程序 3 系列稀释 4 平板接种 1 配制培养基 2 样品准备 6 培养 5倾注放置平板 8 报告 7 计数

42 三 系列稀释 10-1 10-4 10-3 10-2 10-5 10-6 1ml 9ml 1ml

43 四 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 选取菌落数在 30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

44 五 菌落总数计算公式 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算。 式中： N——样品中菌落数；
∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。

45 六 菌落总数的报告 菌落数小于 100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。

46 七 菌落计数实例 例次 稀 释液及 菌 落 数 菌落总数 （个/g或个ml） 报告方式（个/g或ml） 10-1 10-2 10-3 1 多不可计 164 20 16400 1.6×104 2 295 62 31272 3.1×104 271 60 3 313 313000 3.1×105 4 27 11 5 270 2.7×102 <10 6 305 12 30500 3.0×104

47 八 注意事项 操作要在无菌的状态下进行。 操作时间越短越好。 样品不同选择的稀释倍数不同。 培养基冷却温度不宜过高或过低。

48 谢谢 高锦洪 云南省曲靖农业学校食品技术学部 联系电话：