第十五章 甾体激素类药物 的分析 Analysis of Steroid Hormones.

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1 第十五章 甾体激素类药物 的分析 Analysis of Steroid Hormones

2 发现与发展 1、甾体激素是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质。
2、1932年至1939年间，从腺体中获得雌酮(Estrone，1932年)、雌二醇(Estradiol,1932年)、睾酮(Testosterone，1935年)及皮质酮(Corticosterone,1939年)等的纯品结晶，之后又阐明了其化学结构，从此开创了甾体化学和甾体药物化学的新领域。随后，又有许多重大的成就。 3、发明用薯蓣皂甙(Diosgenin)为原料进行半合成生产甾体药物，使生产规模扩大，成本降低。 4、发现肾上腺皮质激素治疗风湿性关节炎及其在免疫调节上的重要价值，使甾体药物成为医院中不可缺少的药物。 5、甾体口服避孕药的研究成功，使人类生育控制达到了新水平。

3 18 12 17 11 19 13 C D 16 1 2 14 9 10 15 8 A B 3 7 5 4 6 基本结构：环戊烷并多氢菲

4 分类： 肾上腺皮质激素 雄性激素及蛋白同化激素 甾体激素 性激素 孕激素 雌激素

5 （一）肾上腺皮质激素

6

7 肾上腺皮质激素 氢化可的松（天然）

8 肾上腺皮质激素 醋酸地塞米松 （合成）

9 肾上腺皮质激素主要结构特征 （1）A环4-3-酮结构，有紫外吸收 （2）D环的C17上-醇酮基，有还原性。 （3）10位、13位-甲基， 11位羟基、羰基等受立体效应影响， 无利用价值； 人工合成品：1、2位间有双键，6，9位引入卤素，16或16位引入甲基，16位引入羟基。

10 肾上腺皮质激素 主要活性基团 性 质 △4 – 3 – 酮 UV、与羰基试剂反应 C17 – α – 醇酮基 还 原 性

11 （二）雄性激素 睾酮（天然） △４-3-酮

12 丙酸睾酮（合成）

13 蛋白同化激素 苯丙酸诺龙（合成）

14 雄性激素及蛋白同化激素 结构特点： 雄性激素母核含有19个C， 蛋白同化激素的C10位无角甲基，母核含有18个C，
A环的4-3-酮，有紫外吸收； C17位b羟基或由它们形成的酯

15 雄性激素及蛋白同化激素 主要活性基团 性 质 △4 – 3 – 酮 UV、与羰基试剂反应

16 （三）孕激素 黄体酮（天然）

17 人工合成孕激素分类： 孕酮类：醋酸甲地孕酮 睾酮类：炔诺酮、左炔诺孕酮

18 孕酮类 口服 孕激素活性增强 醋酸甲地孕酮

19 睾酮类 在睾酮的17α位引入乙炔基，得到炔孕酮。 炔孕酮 大大降低了雄激素活性，具有抑制排卵作用，口服孕激素活性比黄体酮强15倍。

20 去掉炔孕酮C19甲基，得到活性更强炔诺酮，是人类历史上第一个口服避孕药。
炔诺酮的18位引入一个甲基，得到左旋体口服药左炔诺孕酮 是第一个实现工业化生产的全合成甾类激素。 18 左炔诺孕酮

21 孕激素结构特点 A环的4-3-酮，有紫外吸收； C17位有甲酮基 或乙炔基 多数在C17位上有羟基或被酯化。

22 孕激素 主要活性基团 性 质 △4 – 3 – 酮 UV、与羰基试剂反应 C17 –甲酮基 与亚硝基铁氰化钠反应 C17 –乙炔基
性 质 △4 – 3 – 酮 UV、与羰基试剂反应 C17 –甲酮基 与亚硝基铁氰化钠反应 C17 –乙炔基 与AgNO3反应

23 抗孕激素 孕激素拮抗剂指与孕激素竞争受体并拮抗其活性的化合物，也称抗孕激素。 在20世纪80年代抗孕激素尚未成为药物。
1982年法国Roussel-Uclaf公司推出米非司酮作为抗早孕药 促进了抗孕激素及抗皮质激素药物的发展。 是甾体药物研究历史上的一个里程碑。

24 与炔诺酮相比，在三个位置上进行了结构修饰
米非司酮

25 临床应用 米非司酮在靶细胞上竞争性抑制孕激素。 - 黄体期和妊娠期的激素 妊娠早期使用可诱发流产。 抗早孕时与前列腺素类药合用。
-如口服200mg后再口服1mg 对早孕妇女可获得90～95%的完全流产率 前列腺素类

26 （四）雌激素 卵泡激素 （雌二醇）天然 （estradiol） 3 苯环

27 （炔雌醇） （ethinylestradiol）
雌激素 （炔雌醇） （ethinylestradiol） 乙炔基

28 雌激素的结构特征 A环为苯环，3位上有酚羟基或成酯 D环17位：b羟基或成酯、有些药物有-乙炔基

29 雌激素 主要活性基团 性 质 A环为3–OH 苯环 UV、与重氮苯磺酸盐反应 C17 –乙炔基 与AgNO3反应

30 二、鉴别试验 (一)物理常数的测定 1熔点 2比旋度 3吸收系数

31 （二）化学鉴别法 （1）与强酸的显色反应（各国药典） （母核） H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl 甾体激素类药物 呈色或荧光

32 与硫酸显色反应 显 色 荧光 加水稀释 泼尼松龙 深红 絮状↓灰 泼尼松 橙 黄→蓝绿 炔雌醚 橙红 黄绿 ↓红色 炔雌醇 橙红 黄绿 絮状↓玫红 醋酸可的松 黄或微 褪色并澄 带橙 清

33 (2) 官能团的反应 1 C17 – α – 醇酮基 还原性 A. 呈色反应 肾上腺皮质激素药物 四氮唑盐 OHˉ 呈色

34 B. 沉淀反应 氨制硝酸银 肾上腺皮质激素药物 Ag↓黑色 碱性 酒石酸铜 Cu2O↓红色

35 2. C3–酮基和C20–酮基 甾酮类激素药物 羰基试剂 呈色 ＃常用的羰基试剂： 2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼

36 异烟腙（黄色） 睾酮

37 黄体酮 异烟双腙（黄色）

38 3. C17-甲酮基 具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物 亚硝基铁氰化钠 间二硝基酚 芳香醛 呈色

39 黄体酮 蓝紫色 亚硝基铁 氰化钠 其他甾体 淡橙色 不显色

40 黄体酮

41 蓝紫色

42 4. 酚羟基（JP） 雌激素类药物 重氮苯磺酸 红色偶 氮染料

43 5. 乙炔基 5. 乙炔基 含炔基的甾体激素 含炔基的甾体激素 硝酸银 银盐沉淀 ↓

44 炔雌醇 白

45 6. 有机卤素 呈色 茜素氟蓝 硝酸亚铈 有机氟 Fˉ 有机破坏 有机氯 Clˉ 硝酸—硝酸银 AgCl↓

46 茜素氟蓝 F- 蓝紫色

47 7 酯的反应 醋酸 香

48 特臭 特臭

49 （3） UV法 △４-3-酮 nm 苯环 nm

50 ν （4） IR法 （原料药） 3750～3300cm-1 3300～3000cm-1 3000～2700cm-1

51 炔雌醇 结构特征：酚羟基、C17 –OH C17 –乙炔基

52 ν ν ν 3300cm-1 1615cm-1 1590cm-1 3610cm- 3505cm- 1505cm-1 苯环的骨架振动 酚羟基
醇羟基

53 （5） TLC法 主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别 方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。

54 （6） HPLC法 方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。

55 三、 特殊杂质检查 （一）有关物质的检查 与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体”

56 1. 来源 原料、中间体、异构体、降解产物 2 特点 （1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似

57 3. 方法（具有一定分离能力） TLC法（自身稀释对照法） HPLC法（主成分自身对照法）

58 （1）TLC法（自身稀释对照法） 判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色

59 醋酸氟氢松 检查 其他甾体 取本品加氯仿-甲醇（9 ：1）制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9 ：1）稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97 : 3）为展开剂，展开后晾干，在105℃干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试

60 液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。
1 2

61 特点： （1）简便易行，不需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）只能控制单个杂质的限量； （4）要求杂质与主成分的显色灵敏度接近。

62 （2）HPLC法（主成分自身对照法） 判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积

63 醋酸甲地孕酮 检查 其他甾体 取本品适量，精密称定，以无水乙醇为溶剂，配制成每1ml含2mg的溶液（1）与每1ml含0.04mg的溶液（2），用含量测定项下的方法和溶液(0.16mg/ml)，取10μl注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1）

64 和溶液（2）各10μl，进样。记录至主成分峰保留时间的2倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的1/2和3/4。
供试溶液：溶液（1）2mg/ml 对照溶液：溶液（2）0.04mg/ml

65 特点： （1）需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）可以控制杂质的总量；

66 （二）硒的检查 剧毒 来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢 原理

67 醋酸氟氢松 检查 硒 取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05ug/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至 后，转移至分液漏斗中，用水

68 少量分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（1→2）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基奈试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2′，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。 规定 A供＜A对。

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70 （三）残留溶剂的检查 甲醇和丙酮 GC法 甲醇 ≤0.3% 丙酮 ≤0.5% 内标法 + 校正因子

71 （四）游离磷酸盐 磷钼酸比色法 地塞米松磷酸钠 氢化可的松磷酸钠 倍他米松磷酸钠 氢化泼尼松磷酸钠

72 方法：

73 地塞米松磷酸钠 检查 游离磷酸 精密称取本品20mg，置25ml量瓶 中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫 酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶 液1ml，加水至刻度，摇匀，在20℃放 置30～50分钟，照分光光度法，在740 nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法 处理的吸收度比较，不得更大。

74 （对照液 %KH2PO4）

75 四、含量测定 （一）HPLC法 RP－HPLC（大多内标法） 特点 用样量少，灵敏度高，分离效 果好，测定速度快
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶(C18或ODS柱) , 流动相：CH3OH-H2O , 检测器：UVD（ 240nm,254nm或280nm ） 特点 用样量少，灵敏度高，分离效 果好，测定速度快

76 （二）UV法 △４-3-酮 nm（±） 肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素 苯环 nm（±） 雌激素

77 强分光光度活性药物 弱、非分光光度活性药物
（三）比色法 强分光光度活性药物 弱、非分光光度活性药物 化学反应 1. 适用于非分光光度活性药物 2. 使待测组分光谱位移，避免干扰 3. 增加测定灵敏度 4. 增加选择性 提问可采用什么方法来提高甾体激素类药物的分光光度活性。

78 四氮唑比色法 1. 原理 肾上腺皮质激素类 C17 -α－醇酮基 强还原性 OH - [还原]

79 [O] 分子重排 OH-

80 氯化三苯四氮唑 （TTC） 红四氮唑（RT） 三苯甲瓒↓深红

81 蓝四氮唑（BT）

82 双甲瓒（暗蓝）

83 2. 方法 对照品法 40～45′ 暗 ChP TTC（RT） BP TTC（RT） USP BT

84 3. 讨论 （1） 溶剂、水分的影响 含水量＞5%→ν↓ — 无水乙醇 含水10%→A↓10% 含水30%→几无反应 — 无醛无水乙醇 醛 → A↑

85 （2）碱的种类及加入顺序 反应应在强碱性（pH ＞ 13.75） 条件下进行 以氢氧化四甲基铵的结果最佳 加入顺序：

86 （3） O2与光线的影响 怕光 →避光、快速 反应过程 反应产物 O2影响颜色强度和稳定性 →隔绝空气、 快速、充N2

87 （4） 温度与时间 t℃↑→ν↑→甲瓒分解↑→%↓ ChP ℃ ～45′ BP ℃ h

88 （5） 基团对反应速度的影响 C11= O＞ C17－OH C21－OH＞ C21-酯 C16无论何种取代基ν↓

89 4. 特点： 缺点 影响因素太多 优点 测定结果能指示药品 的稳定性（氧化及降 解产物无此反应）

90 异烟肼比色法 C3－酮基 肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同 化激素、孕激素 1. 原理 HCl （缩合）

91 异烟腙（黄色）

92 2. 方法 对照品法

93 3.讨论 （1）溶剂的选择 无水甲醇 无水乙醇（植物油制剂） (2) 酸、异烟肼的量 盐酸 : 异烟肼 = 2 : 1 A最大

94 （3）水分、O2 、光线与温度的影响 含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓ 具塞玻璃容器中反应→ O2与光线无影响 t℃ ↑ → ν↑

95 （4） 反应专属性 C3= O ＞ C17= O 、 C20= O C11= O 不反应 反应专属性 C3－酮基

96 Kober反应比色法 雌激素 1. 原理

97 Kober反应缺点： （1）条件较难控制，易出双色→黄+红 （2）重现性较差： ① 呈色强度和稳定性受试剂浓度、组成、反应时间和温度的影响。
① 呈色强度和稳定性受试剂浓度、组成、反应时间和温度的影响。 ② 甾体激素提取物中其他物质及制剂中稳定剂、赋形剂、溶剂对测定有干扰。

98 铁-酚试剂法 ①   铁酚试剂的组成 硫酸亚铁铵、浓硫酸 、过氧化氢、 苯酚 ②   浓硫酸和过氧化氢的作用 浓硫酸和过氧化氢将2价铁氧化成3价铁。

99 ③三价铁的作用 ⅰ．能够加快黄色生成的速度 ⅱ．能促进黄色向红色的转变 ⅲ．能增加红色的稳定性 ④   苯酚的作用 ⅰ．可消除反应产生的荧光 ⅱ．能够促进红色的生成

100 中国药典 Kober 反应吸收光谱 第一步反应 第二步反应 515 465
nm A Kober 反应吸收光谱 第一步反应 采用本法测定炔雌醇片及复方炔诺酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮片中的炔雌醇的含量

101 比色法与紫外分光光度法的比较 比色法 紫外法 药物需经处理显色 不需要 可见光 可见－紫外区 比色计、分光光度计 紫外分光光度计
比色法 紫外法 药物需经处理显色 不需要 可见光 可见－紫外区 比色计、分光光度计 紫外分光光度计 单色光纯度不够，A不恒定 单色光足够，A恒定 对照品比较法（显色影响因素多） 吸收系数法，对照品比较法

102 （四）非水溶液滴定法 米非司酮（二甲氨基）具有弱碱性，ChP采用非水溶液滴定法测定其含量 冰醋酸 结晶紫 高氯酸 空白试验校正
反应摩尔比1：1

103 六.生物样品中甾体激素分析 生物体中内源甾体激素及其代谢产物干扰测定，且浓度低，所以首选GC，HPLC，GC-MS和HPLC-MS