第 四 章 酶.

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1 第 四 章 酶

2 学习导航 概述 酶的命名和分类 酶的作用机制 影响酶促反应的因素 酶的分离提纯及活力测定

3 酶的概念 酶是一类由活细胞产生的具有催化作用的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸。

4 酶学研究简史 公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。
1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。 1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。 1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。 1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。

5 第一节 概述

6 一、酶是生物催化剂 1、酶与一般催化剂的共同特点 用量少而催化效率高 不改变化学反应的平衡点 可降低反应的活化能

7 一、酶是生物催化剂 2、酶作为生物催化剂的特征 酶易失活：要求反应条件温和 催化效率高 高度专一性 活力可调节
酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。例： 1mol过氧化氢酶1min催化5×106mol,而Fe2+只能催化6×10-4 高度专一性 活力可调节

8 酶专一性类型 1 结构专一性 概念：酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结构的特殊要求和选择 类别：绝对专一性和相对专一性
2 立体异构专一性 概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性

9 绝对专一性和相对专一性 绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。
绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。 相对专一性 有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。 1） 键专一性 有的酶只作用于一定的键，而对键 两端的基团并无严格要求。 2）基团专一性 另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。

10 消化道内几种蛋白酶的专一性 氨肽酶 羧肽酶 羧肽酶 （芳香） （硷性） （丙） 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 弹性蛋白酶 胰蛋白酶

11 活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。
反应总能量改变 非催化反应活化能 酶促反应 活化能 一般催化剂催 化反应的活化能 能 量 反 应 过 程 底物 产物 酶促反应活化能的改变

12 二、酶的化学本质 1、酶的本质 酶的本质绝大部分是蛋白质 实验证明：酶的组成，性质，脲酶结晶，核 酸酶的人工合成。
实验证明：酶的组成，性质，脲酶结晶，核 酸酶的人工合成。 少数为核酸（核酶、脱氧核酶）

13 2、酶的化学组成 单纯酶 (simple enzyme) 结合酶(全酶 conjugated enzyme)
决定反应的特异性 蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme) 辅助因子 (cofactor) 金属离子 小分子有机化合物 全酶 (holoenzyme) (常常含有维生素) K+、Na+、Mg2+、Fe2+、Cu+、 Zn2+、等 决定反应的 种类与性质

14 辅酶 辅基 辅助因子分类 （按其与酶蛋白结合的紧密程度） 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。
与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。

15 小分子有机化合物在催化中的作用

16 酶的不同形式 单体酶(monomeric enzyme) 寡聚酶(oligomeric enzyme)
多酶体系(multienzyme system) 多功能酶(multifunctional enzyme)或串联酶(tandem enzyme)

17 第二节 酶的命名和分类 一、酶的分类 二、酶的命名

18 一、分类 国际酶学委员会（enzyme commission,EC)将所有的酶促反应分为六大类： （1）氧化-还原酶 （2）转移酶
（3）水解酶 （4）裂合酶 （5）异构酶 （6）合成酶

19 1、习惯命名 根据作用的底物, 反应类型,底物加反应类型等命名。
二、酶的命名 1、习惯命名 根据作用的底物, 反应类型,底物加反应类型等命名。 2、系统命名 要给出所有的反应底物及反应性质，如： 转氨酶（习惯名）→丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶（系统名）。 习惯名称简便故常用。

20 3、国际编号 分类中的六大类，分别用1，2，3，4，5，6表示，再依底物或基团的性质分为亚类，用1，2，…表示。亚类可再分，各数字之间可用“、”隔开。即用四位数字表示一个酶的编号。前面冠以“EC”酶学委员会。 如3代表水解酶，3.1水解脂键（脂肪酶、磷酸酶），3.2水解糖苷键（淀粉酶），3.4水解肽键（蛋白酶）等。EC 为乳酸：NAD+氧化还原酶。

21 4、其它命名分类法 单体酶(monomeric enzyme) 寡聚酶(oligomeric enzyme)
只含一条多肽链，分子量在13000~35000之间，如：胰蛋白酶 。 寡聚酶(oligomeric enzyme) 由几个甚至几十个亚基组成分子量在35000~几百万，如：乳酸脱氢酶。 多酶体系(multienzyme system) 是由几个酶彼此嵌合形成的复合体，分子量一般在几百万。

22 第三节 酶的作用机制 一、酶的活性中心 二、酶原与酶原的激活 三、同功酶 四、酶活性的调节 五、酶促作用机制

23 一.酶的活性中心 *酶活性中心的概念 *必须基团: 1.结合基团 2.催化基团 3.活性中心以外的必须基团

24 酶的活性中心 必需基团(essential group) 酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。

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26 常见的必须基团: 谷氨酸、天冬氨酸—羧基 精氨酸—胍基 组氨酸—咪唑基 赖氨酸—氨基 丝、苏、酪氨酸—羟基 半胱氨酸—巯基等

27 二、酶原与酶原的激活 酶原: . 酶原的激活 . 酶原激活的意义 胰蛋白酶元 胰蛋白酶(有活性) 六肽 （ 肠激酶、Ca2+）

28 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽
酶原激活的机理 酶 原 分子构象发生改变 形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 在特定条件下

29 肠激酶 胰蛋白酶 甘 异 赖 缬 天 组 丝 S 46 183 活性中心 甘 异 缬 组 丝 S 赖 缬 天 胰蛋白酶原的激活过程

30 三、 同工酶 * 定义 同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。

31 * 举例：乳酸脱氢酶(LDH1～ LDH5) H M LDH1 (H4) LDH2 (H3M) LDH3 (H2M2) LDH4 (HM3)
乳酸脱氢酶的同工酶

32 LDH 乳酸 丙酮酸 NAD NADH+H+ CH3 CH3 C O CHOH COOH COOH

33 *生理及临床意义 在代谢调节上起着重要的作用； 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征； 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；
同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。 心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化 1 酶活性 心肌梗死酶谱 正常酶谱 肝病酶谱 2 3 4 5

34 四、酶活性的调节 1、 变构酶 变构调节、 变构部位、变构效应剂（变构激活、变构抑制） 2、酶的化学修饰调节 化学修饰调节：
1、 变构酶 变构调节、 变构部位、变构效应剂（变构激活、变构抑制） 2、酶的化学修饰调节 化学修饰调节： 修饰的方式、修饰的部位

35 变构酶常为多个亚基构成的寡聚体，具有协同效应
[S] V 变构激活 无变构效应剂 变构抑制 变构酶的Ｓ形曲线

36 蛋白激酶 磷蛋白磷酸酶 酶蛋白 酶蛋白 酶的磷酸化与脱磷酸化 ATP ADP Thr Ser Tyr -O-PO32- -OH Thr
H2O Pi 磷蛋白磷酸酶 酶的磷酸化与脱磷酸化

37 五、酶的催化作用机制 1、中间产物学说 ES稳定性差，只能存在，不能分离出来。 E + S k1 k2 k3 ES E + P

38 2、酶作用专一性机理 锁钥学说：将酶的活性中心比喻作锁孔，底物分子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。
诱导契合学说：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。

39 酶专一性的“锁钥学说”

40 酶专一性的“诱导契合学说”

41 羧肽酶的诱导契合模式 底物

42 3、与酶的高效率有关的主要因素 1、 邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化 4、 酸碱催化 5、微环境影响
1、 邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化 4、 酸碱催化 5、微环境影响 实例: 胰凝乳蛋白酶

43 3、与酶的高效率有关的主要因素 1、 邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化 4、 酸硷催化 5、微环境影响
1、 邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化 4、 酸硷催化 5、微环境影响 实例: 胰凝乳蛋白酶

44 酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团

45 第四节 影响酶促反应的因素

46 ※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
概念 研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。 影响因素 酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 ※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。

47 一、底物浓度对反应速度的影响 研究前提 单底物、单产物反应 酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示
反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度 底物浓度远远大于酶浓度 在其它因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。

48 [S] V Vmax 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。

49 反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。
[S] V Vmax 随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。 目 录

50 反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应
[S] V Vmax 当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应 目 录

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52 1、米－曼氏方程式 ※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。 Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── [S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)

53 Km值的推导 Vmax[S] Vmax ＝ 2 Km + [S] Km＝[S] 当反应速度为最大反应速度一半时 V Vmax Vmax/2
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。

54 2、Km与Vmax的意义 Km值 1、 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度、是酶的特征性常数之一；

55 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。
意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。

56 酶的转换数 定义 — 当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。 意义 — 可用来比较每单位酶的催化能力。

57 双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
3、Ｋm值与Ｖmax值的测定 双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法 Vmax[S] Km+[S] V = 两边同取倒数 （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S]

58 [S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax
Hanes作图法 在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S] [S] [S]/V -Km Km/Vm [S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax

59 二、酶浓度对反应速度的影响 当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 [E] V [E]
V [E] 当[S]>>[E]时，Vmax = k3 [E] 酶浓度对反应速度的影响 当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 [E]

60 三、温度对反应速度的影响 双重影响 最适温度 ： 酶促反应速度最快时的环境温度。 * 低温的应用
温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。 酶 活 性 0.5 1.0 2.0 1.5 温度 ºC 温度对淀粉酶活性的影响 最适温度 ： 酶促反应速度最快时的环境温度。 * 低温的应用

61 四、 pH对反应速度的影响 最适pH ： 酶催化活性最大时的环境pH。 pH对某些酶活性的影响 酶 活 性 pH 胃蛋白酶 淀粉酶 胆碱酯酶
酶 活 性 pH pH对某些酶活性的影响 胃蛋白酶 淀粉酶 胆碱酯酶 2 4 6 8 10 最适pH ： 酶催化活性最大时的环境pH。

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63 五、抑制剂对反应速度的影响 酶的抑制剂 区别于酶的变性 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白 变性的物质称为酶的抑制剂。
凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白 变性的物质称为酶的抑制剂。 区别于酶的变性 抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性

64 抑制剂类型和特点 非专一性不可逆抑制剂 不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂 竞争性抑制剂 可逆抑制剂 非竞争性抑制剂

65 1、 不可逆性抑制作用 * 概念 * 举例 抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。 有机磷化合物  羟基酶
1、 不可逆性抑制作用 * 概念 抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。 * 举例 有机磷化合物  羟基酶 解毒 解磷定(PAM) 重金属离子及砷化合物  巯基酶 解毒 二巯基丙醇(BAL)

66 2、 可逆性抑制作用 * 概念 * 类型 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制
抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。 * 类型 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制

67 + 竞争性抑制作用 I EI E + S E + P ES 反应模式 定义
抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 反应模式 + I EI E + S E + P ES

68 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度； 1/V
* 特点 I与S结构类似，竞争酶的活性中心； 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度； 无抑制剂 1/V 1/[S] 抑制剂↑ 动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。

69 * 举例 丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2 延胡索酸

70 磺胺类药物的抑菌机制 与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶 二氢蝶呤啶 ＋ 对氨基苯甲酸 ＋ 谷氨酸 二氢叶酸 合成酶

71 非竞争性抑制 * 反应模式 E+S ES E+P + I EI+S EIS + S － S + ESI EI E ES P

72 * 特点 抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系； 抑制剂↑ 1 / V 1/[S] 无抑制剂 抑制程度取决于抑制剂的浓度； 动力学特点：Vmax降低，表观Km不变。

73 反竞争性抑制 * 反应模式 E+S E+P ES + I ESI + E S ES ESI P

74 * 特点： 抑制剂只与酶－底物复合物结合； • 抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度； 1/V 1/[S] 无抑制剂 抑制剂↑ 动力学特点：Vmax降低，表观Km降低。

75 各种可逆性抑制作用的比较

76 六、激活剂对反应速度的影响 定义：凡能使酶活性增加进而加快υ的物质 常见激活剂
为无机离子K+、Na+、Cl-。其作用维持并组成活性中心，或组成辅因子的成分。 另一类为有机小分子 如Cys、GSH。使-SH酶恢复活性；EDTA使被重金属抑制的酶恢复活性。

77 第五节 酶的分离提纯及活力测定 一、酶的分离提纯。 二、活力测定
第五节 酶的分离提纯及活力测定 一、酶的分离提纯。 二、活力测定 1、酶活力(enzyme activity) 又称酶活性，是催化一定化学反应的能力，用酶反应速度（υ）表示。即υ越大，酶活力越大。 2、酶反应速度（υ） 单位时间的浓度变化。常用初速度表示。 3、酶活力单位（U）

78 3、酶活力单位（U） 国际单位 指在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔（µmoL）底物的酶量。酶活力单位用U表示，但各种酶有自己的规定。
1Kat(1moL/s) 最适条件下，每秒钟内，能使1mol底物转化为产物所需的酶量。故1Kat = 6×107U。 淀粉酶活力单位：每小时催化1g可溶淀粉液化所需的酶量（1U=1g淀粉/h），或每小时催化1mol2%的可溶淀粉液化所需的酶量（1U=1×2%淀粉/h）。 酶含量 常以每克酶制剂或每毫升酶溶液含有的活力单位数表示。即单位（U）/克（毫升）。

79 4、比活力 指每毫克酶蛋白所具有的酶活力。用U/mg蛋白表示，可反映酶纯度。

80 附:酶的应用 （一）酶作为试剂用于检验和科学研究
1．酶法分析 即酶偶联测定法(enzyme coupled assays)，是利用酶作为分析试剂，对一些酶的活性、底物浓度、激活剂、抑制剂等进行定量分析的一种方法。

81 2．酶标记测定法 酶可以代替同位素与某些物质相结合，从而使该物质被酶所标记。通过测定酶的活性来判断被标记物质或与其定量结合的物质的存在和含量。
3．工具酶 除上述酶偶联测定法外，人们利用酶具有高度特异性的特点，将酶做为工具，在分子水平上对某些生物大分子进行定向的分割与连接。

82 1．固定化酶 (immobilized enzyme)
（二）酶作为药物用于临床治疗 （三）酶的分子工程 1．固定化酶 (immobilized enzyme) 将水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。 固定化酶在催化反应中以固相状态作用于底物，并保持酶的活性。

83 2．抗体酶 3．模拟酶 具有催化功能的抗体分子称为抗体酶(abzyme) 。
模拟酶是根据酶的作用原理，利用有机化学合成方法，人工合成的具有底物结合部位和催化部位的非蛋白质有机化合物。

84 问答题 1、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？ 2、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。
3、什么是米氏方程，米氏常数Km的意义是什么？试求酶反应速度达到最大反应速度的99％时，所需求的底物浓度（用Km表示） 4、什麽是同工酶？为什麽可以用电泳法对同工酶进行分离？同工酶在科学研究和实践中有何应用？ 5、举例说明酶的结构和功能之间的相互关系。 6、称取25毫克某蛋白酶制剂配成25毫升溶液，取出1毫升该酶液以酪蛋白为底物,用Folin-酚比色法测定酶活力,得知每小时产生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凯式定氮法测得蛋白氮为0.2毫克。若以每分钟产生1微克酪氨酸的酶量为一个活力单位计算，根据以上数据，求出（1）1毫升酶液中含有的蛋白质和酶活力单位数；（2）该酶制剂的比活力；（3）1克酶制剂的总蛋白含量和酶活力单位数。

85 名词解释 活性中心 全酶 酶原 活力单位 比活力 米氏方程 Km 诱导契合 变构效应 辅酶和辅基 固定化酶