第十一章 抗生素类药物的分析 The Analysis of Aantibiotic drugs

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1 第十一章 抗生素类药物的分析 The Analysis of Aantibiotic drugs

2 第一节　概　　　述 抗生素的来源: ＊多数抗生素生物合成(发酵) ＊少数化学合成或者半合成

3 1、抗生素类药物一般检查项目： ①鉴别试验: 用化学法、物理化学法以 及生物学法来确认是哪种抗生素 ②毒性试验: 控制药品中的毒性物质
③无菌试验: 检查药品中有无杂菌污染 ④热源试验: 控制药品中的致热物质

4 ⑤水分测定: 控制水分含量 ⑥溶液澄明度检查: 检查不溶性物质 ⑦ 溶液pH试验: 测定pH ⑧降压试验: 检查有降压作用的杂质 ⑨   效价测定: 有效成分测定

5 2、效价测定 抗生素的效价测定方法有: 生物学法 物理化学法 目前各国药典仍以生物学测定法为主。

6 (1)     生物学测定法 以抗生素抑制细菌生长能力或杀菌能力作为衡量效价标准 优点： ①原理恰好与临床要求一致，更能 够确定抗生素效价。 ②灵敏度高，需要样品量较小

7 ③ 既适用较纯精制品,也适用于纯度 较差的产品 ④ 已知或新发现抗生素都能应用 ⑤ 同一类型的抗生素,不需要分离, 可一次测定它们的总效价。

8 缺点 ①   操作步骤多，测定时间较长 ②   误差较大

9 (2) 物理化学测定法 根据抗生素化学结构利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行。 优点 ① 操作简单、省时、方法准确
(2)     物理化学测定法 根据抗生素化学结构利用其特有的化学或物理化学性质及反应进行。 优点 ①   操作简单、省时、方法准确 ②   具有较高的专属性

10 缺点: 对于结构相似的抗生素，测定结果往往只能代表总的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效价，只有当用物理化学法测定结果与用生物学法测定效价相一致时，才能用于效价测定。

11 3、本章内容 ＊ -内酰胺类: 青霉素类头孢菌素类 ＊氨基糖苷类: 链霉素　庆大霉素 ＊四环素类:

12 第二节　-内酰胺类抗生素的分析 一、化学结构与性质 1、化学结构 ①   青霉素类结构

13 ＊青霉素类: 母核: 由-内酰胺环和氢化噻唑环 组成的双杂环。 6-APA 6-Aminopenicillanic Acid 侧链 : RCO-　　

14 苄青霉素（青霉素G） R＝ 氨苄青霉素 R＝

15 ② 头孢菌素类结构 母核: -内酰胺环和二氢噻嗪环组成的双杂环。 （7-ACA）7-Aminocephalospoanic Acid
②  头孢菌素类结构 母核: -内酰胺环和二氢噻嗪环组成的双杂环。 （7-ACA）7-Aminocephalospoanic Acid 侧链　RCO-　

16 2、性质 青霉素类和头孢菌素类结构共同特点具有-内酰胺环。 ① 酸性 ＊有羧基，具有酸性 ＊pKa值在2.5~2.8之间 ＊与碱成盐
①   酸性 ＊有羧基，具有酸性 ＊pKa值在2.5~2.8之间 ＊与碱成盐 如：青霉素G钠、青霉素G钾等

17 ②  旋光性 有手性碳原子，具有旋光性 3个手性碳原子 2个手性碳原子

18 ③ 紫外吸收 ＊ 青霉素类母核没有共轭系统，没有紫外吸收
③  紫外吸收 ＊ 青霉素类母核没有共轭系统，没有紫外吸收 ＊ 但青霉素类药物在弱酸性下水解，可以产生具有共轭双键的青霉烯酸，在紫外光区有吸收。 ＊ 侧链中有苯环等取代基的药物，在紫外光区也有吸收。像苄青霉素。

19 头孢菌素类分子中有共轭体系 （O＝C－N－C＝C） 在260nm处有最大吸收。

20 ④  -内酰胺环的不稳定性 干燥、纯净青霉素类抗生素稳定，其水溶液很不稳定. 不稳定的部分是-内酰胺环 -内酰胺环在酸、碱、青霉素酶、某些金属离子的作用下，可使-内酰胺环开环或发生分子重排，而失去抗菌作用。

21 ⅰ ⅱ

22 ⅲ ⅳ

23 二、鉴别试验 1、羟肟酸铁反应

24 2、青霉素的各种盐的鉴别 3、硫酸及硫酸-甲醛反应 4、硫酸-变色酸反应 5、紫外分光光度法及红外分光光度法

25 三、含量测定 1、酸碱滴定法 ①   原理 青霉素在稀碱性条件下,水解生成青霉 噻唑酸衍生物,此步水解定量完成,可用 于含量测定。

26

27 ① 方法 (ⅰ) 水解前：将样品溶液的pH调至8 (ⅱ) 水解：加入定过量的标准碱溶液， 水浴加热使水解
①   方法 (ⅰ) 水解前：将样品溶液的pH调至8 （加0.01mol/L NaOH液至显粉红色） (ⅱ) 水解：加入定过量的标准碱溶液， 水浴加热使水解 (ⅲ) 剩余滴定：水解后，过量的碱用酸 标准液回滴定(至pH8，粉红色→无色)

28 以“青霉素钠”为例 ChP 90 （1）主试验 （2）空白试验： 不加样品，其余操作同上

29 ③ 讨论 (ⅰ) 溶剂 新沸过且用0.01M NaOH液中和的水 目的：消除水中酸性物质影响（如CO2） (ⅱ) 滴定前中和
③   讨论 (ⅰ) 溶剂 新沸过且用0.01M NaOH液中和的水 目的：消除水中酸性物质影响（如CO2） (ⅱ) 滴定前中和 消除能消耗碱的杂质影响（如一些酯 类杂质）

30 (ⅲ) 空白试验目的: 在加热水解过程中，有可能会吸收CO2，对测定有影响，所以要做空白试验校正。 (ⅳ) 本法供试品用量较大，多用于效价高的供试品的测定

31 2、碘量法 ① 原理： 青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，其 在碱性条件下水解生成的降解产物— 青霉噻唑酸可与碘作用，根据消耗的 碘量可以计算青霉素的含量。

32 理论上:1mol青霉素≈8mol I原子 实际上: 1mol青霉素≈8~9mol I原子 ※温度，放置时间，pH，浓度，碘过量程度， 杂质多少等影响因素。

33 ②方法： 以“青霉素钠”为例，ChP 二部 （1）主试验：

34 （2）空白试验：

35 ③ 讨论： （1）溶液的pH值在4.5左右 （2）温度：24~26℃ （3）放置时间：15~20′

36 （4）空白试验：做法与一般空白不同（加样品,不加碱水解,其他操作同样品）
＊目的：消除样品中预先存在的降解产物（青霉噻唑酸）及其他耗碘杂质的影响 （5）灵敏度高：因为1:8，所以供试液浓度在 ~100μg/ml即可测定

37 3、汞量法 ① 原理： 青霉素分子不与汞盐反应，但其降 产物青霉噻唑酸及青酶胺可与汞盐反应， 根据消耗的汞盐量计算青霉素的含量。

38 青霉素分子中的氢化噻唑环含有一个硫原子，开环后形成巯基（—SH），可用汞量法测定

39 4、可见—紫外分光光度法 青霉素在弱酸性下（pH=4），不完 全水解，产生青酶烯酸，在320—360nm 处有强吸收。
① 原理： 青霉素在弱酸性下（pH=4），不完 全水解，产生青酶烯酸，在320—360nm 处有强吸收。 青霉烯酸在酸性溶液中极不稳定，有 两种改进方法。

40 铜离子与青酶烯酸形成稳定的螯合物，在320nm处有最大吸收。
（1）铜盐法（JP13）： 铜离子与青酶烯酸形成稳定的螯合物，在320nm处有最大吸收。 对照品法定量。 用于氨苄青霉素的含量测定。

41 （2）硫醇汞盐法（BP1993） （ChP95） 对照品→同样操作 用于氨苄西林钠的含量测定
青霉素在咪唑的催化下，与氯化高汞定量地反应生成青酶烯酸硫醇汞盐，在324—345nm下有最大吸收。 对照品→同样操作 用于氨苄西林钠的含量测定

42 作用： 咪唑:催化剂,使水解产率高,生成产物稳定 醋酐的乙腈溶液:乙酰化氨苄青霉素侧链 —NH2,使λmax=325nm 硼酸缓冲液:调pH值 HgCl2:微量Hg2+催化剂,促进反应,重现性好。

43 5、HPLC 以“头孢唑林钠”为例 色谱条件： 柱：ODS 流动相：磷酸二氢钾、枸橼酸溶液— 乙腈（88：12） 检测波长：254nm
流动相：磷酸二氢钾、枸橼酸溶液— 乙腈（88：12） 检测波长：254nm 内标物：乙酰苯胺

44 第二节 氨基糖甙类抗生素的分析 一、化学结构及性质 （一）链霉素 1、结构 链霉胍 链霉糖 N-甲基-L-葡萄糖胺

45 2、性质： （1）三个碱性中心： 2个强碱性胍基（PKa=11.5） 1个甲胺基（PKa=7.7） 可与矿酸或有机酸成盐
（2）链霉素在酸性或碱性条件下可变为链霉胍和链霉双糖胺

46 （二）庆大霉素 1、结构 紫素胺 脱氧链霉胺 N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺 ＊三个类似结构的C1、C2、C1a组成的混合物
C1：R1=R2=CH3 ;C2：R1=CH3,R2=H ;C1a：R1=R2=H,R3=H

47 2、性质： （1）五个碱性中心——PKa~8 可与矿酸或有机酸成盐 （2）无UV吸收，（因为无共轭系统）

48 二、鉴别试验 （一） 共同反应 1、茚三酮反应 氨基糖苷结构，具羟基胺类和α— 氨基酸的性质，可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物。

49 2. N-甲基葡萄糖胺反应: 水解产物N-甲基葡萄糖胺特有反应

50 （二）链霉素的特征反应 1、麦芽酚反应： 链霉素在碱性溶液中，链酶糖经分子重排，消除N—甲基葡萄糖胺及链酶胍，生成麦牙酚，麦牙酚可与铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物。

51 2、坂口反应： 本品水溶液，加氢氧化钠试液，水解为链酶胍，与8—羟基喹啉作用，再加次溴酸钠试液，生成橙红色化合物。

52 第三节 四环素类抗生素的分析 一、化学结构 四骈苯或萘骈萘的衍生物， 氢化骈四苯环

53 四个取代基 R R′ R″ R′″ 四环素(TC) H OH CH3 金霉素(CTC) Cl 土霉素(OTC)

54 四个环 A环 B环 C环 D环 二甲氨基—N(CH3)2 酚羟基 酰胺基—CONH2 酮基与烯醇共共轭 酮基与烯醇基共轭 双键系统

55 二、性质 1、呈两性： 弱酸性——酚羟基、烯醇型羟基 弱碱性——二甲胺基 所以遇酸或碱均可成盐

56 2、含结晶水 四环素：6个结晶水占19.6% 土霉素：2个结晶水占7.5% 加热时可失去结晶水,当含水量 低于19.6%的四环素和低于7.5%的土 霉素,置于空气中要吸收水分。

57 3． 溶解度： 游离体在水中溶解度很小，溶解度与pH有关。pH4.5~7.2难溶于水, pH低于4或高于8时,可以得到高浓度的水溶液.

58 4．对氧化剂不稳定： 对各种氧化剂都不稳定，且碱性水溶液特别易氧化，颜色很快变深形成色素，干燥品较稳定，但贮存时遇光可使颜色变深（因空气氧化）。

59 三．化学反应： 1. 差向异构化反应：（差向四环素）
弱酸性（pH2.0~6.0）溶液中，A环上手性C4构型的改变，发生差向异构化，形成差向四环素。 差向化速度的影响因素：pH<2或 pH>9时，差向化速度很小。高价的无机酸或有机酸根存在或阴离子浓度增加，差向化速度增大。

60 ＊四环素和金霉素很易差向异构化，形成4-差向四环素、4-差向金霉素，他们的抗菌性极弱或完全消失。
＊土霉素和强力霉素由于C5上的羟基和二甲胺基形成氢键，不易发生差向异构化。

61 2. 酸性下降解反应:（脱水四环素类） 在酸性（pH<2）时，C环上C6上羟基易脱落与C5a上的氢生成水，在C6-C5a间形成双键。经重排使C环芳构化，生成脱水四环素类 四环素、土霉素和金霉素可发生脱水；强力霉素不发生（C6无OH）。

62 3. 碱性下降解反应：（异四环素类） 在碱性下，C环打开，生成无活性的具有内酯结构的异四环素；若强碱性下加热，可定量地转化为异四环素，后者具有强烈荧光，可荧光法测定。 强力霉素不发生反应，因C6无OH。

63 4. 与金属离子络合： 能与许多金属离子（锆Zr4+,铀U6+,锌Zn2+,铜Cu2+,铝Al3+,镁Mg2+，铈Ce4+,钴Co2+）形成有色络合物。

64 四．鉴别 1.  与浓硫酸反应： 四环素类 + 浓H2SO4 → 深紫色（四环素） 蓝色,迅速转变为绿（金霉素） 朱红色（土霉素）

65 2. FeCl3反应： 四环素类酚羟基 + FeCl3 → 红棕色（四环素） 深褐色（金霉素） 橙褐色（土霉素）

66 3．  荧光反应： 四环素类在紫外灯下产生荧光，其降解产物也具有荧光，可供鉴别。

67 五．杂质检查： 降解产物及异构杂质,会造成药品质量 下降。可引起恶心、呕吐、糖尿、蛋白尿 及酸中毒，称为Fanconi症侯群。

68 引起毒性反应的主要物质为差向 异构体、脱水物、差向脱水物质，统 称为有关物质。 ChP2005采用HPLC法检查。 脱水物和差向脱水物含量越高， 其吸收度越大，因此，ChP还规定杂 质的吸收度的限量。