实验五 化脓性球菌 实验五 化脓性球菌 通过实验，认识化脓性球菌各自的形态、菌落特征，掌握葡萄球菌产生的凝固酶的测定方法。

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1 实验五 化脓性球菌 实验五 化脓性球菌 通过实验，认识化脓性球菌各自的形态、菌落特征，掌握葡萄球菌产生的凝固酶的测定方法。
实验五 化脓性球菌 实验五 化脓性球菌 通过实验，认识化脓性球菌各自的形态、菌落特征，掌握葡萄球菌产生的凝固酶的测定方法。 球菌是细菌中的一大类。对人类有致病性的病原性球菌主要引起化脓性炎症，所以称为化脓性球菌，其中革兰氏阳性菌主要包括葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌；革兰氏阴性菌包括脑膜炎球菌和淋球菌等。

2 1.链球菌：G+，链状排列 首先我们要掌握化脓性球菌的形态。
在第一次试验中大家已经观察了葡萄球菌的形态，并画了图。葡萄球菌是中等大小、葡萄串状排列的革兰阳性球菌。这次给大家示教的是链球菌、淋球菌。链球菌是革兰阳性，链状排列的球菌，看起来像一串珍珠项链。

3 2.淋病奈瑟菌：G-球菌，常成双排列，似咖啡豆形，大多位于中性粒细胞中
淋病奈瑟菌，俗称淋球菌，能引起淋病，是革兰阴性、成双排列的球菌，似咖啡豆形，急性炎症大多位于中性粒细胞中，慢性炎症多位于细胞外。我们看图中大的红色的团块是中性粒细胞的分叶核，箭头所指的众多小点是淋球菌，革兰染色阴性呈红色。 2.淋病奈瑟菌：G-球菌，常成双排列，似咖啡豆形，大多位于中性粒细胞中

4 3.观察三种葡萄球菌在普通琼脂平板上的菌落特点
接下来我们观察金黄色、表皮、腐生葡萄球菌在普通琼脂平板上的菌落性状，主要观察产生色素的差别。金黄色葡萄球菌产生金黄色色素，菌落金黄色。表皮葡萄球菌菌落白色，腐生葡萄球菌白色或柠檬色。其中，产生金黄色色素是葡萄球菌是否有致病性的一个重要参考指标。

5 4.观察金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌在血平板上的菌落形态、大小及溶血情况
我们还要观察金葡菌及乙型溶血性链球菌（简称乙链）在血平板上的溶血情况。金葡菌产生溶血素，可以导致完全溶血，即β溶血现象，在菌落周围可看到完全透明的溶血圈。链球菌根据溶血性分为三种，甲型溶血性链球菌在菌落周围出现草绿色溶血圈，为α溶血；乙链产生完全透亮的溶血圈，为β溶血，丙型链球菌没有溶血性，菌落周围不出现溶血圈。左图和右图中可见金葡菌、乙链有β溶血性。

6 5.血浆凝固酶试验 5-1 试管法----测定游离凝固酶 5-2 玻片法----测定结合凝固酶 凝固酶试验
凝固酶是指葡萄球菌产生的能使加有抗凝剂的人和兔血浆凝固的酶类物质，是鉴定致病性葡萄球菌的重要指标，包括游离凝固酶和结合凝固酶。葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金葡菌与其他葡萄球菌。 葡萄球菌所产生的凝固酶有两种：结合凝固酶和游离凝固酶。 结合凝固酶是一种结合于菌体细胞壁的酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使之变成纤维蛋白，而使葡萄球菌凝集成块。结合凝固酶用玻片法检测。游离凝固酶是凝血酶原样物质，不直接作用于血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后，变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变为固态纤维蛋白，从而使血浆凝固。游离凝固酶用试管法检测。 凝固酶试验(玻片法)：大家自己操作。 (1) 每人取载玻片1张，分两区，用接种环各取1滴生理盐水分别置于两区。 (2) 取斜面上的葡萄球菌混悬于玻片上的生理盐水内。注意菌不能太少，否则会影响凝集结果产生。 (3) 于左侧细菌悬液内加入兔血浆1滴，混匀。 (4) 数秒钟后观察结果，右侧细菌悬液应无凝集。左侧细菌凝集成块时为阳性，无凝集则为阴性。 凝固酶试验(试管法)：是示教内容。 (1)取小试管两支，每支加1：4稀释的新鲜兔血浆或人血浆0.5毫升。 (2)其中一支加被检细菌生理盐水悬液或肉汤培养物0.5毫升，另一支加生理盐水或肉汤培养基0.5毫升作阴性对照。 (3) 将试管置37 ℃水浴箱中，每隔３０分钟，观察一次结果。 (4)在３小时内，若试验管出现凝固呈果冻状，阴性对照管不出现凝固，为阳性。多数凝固酶阳性细菌，在半小时～１小时内发生凝固，极少数阳性细菌须在２４小时后才发生凝固，说明凝固能力较弱。

7 紫外线杀菌试验结果 S.aureus B.subtilis 下面观察上次试验结果：
首先是紫外线杀菌试验：比较四个区域的细菌生长状况：这四个区域是1、紫外线直接照射已接种金葡菌的区域。2、紫外线直接照射已接种枯草杆菌的区域。3、隔玻璃照射已接种金葡菌的区域。4、隔玻璃照射已接种枯草杆菌的区域。注意比较有没有长出菌苔或菌落，长得是否旺盛。说明了紫外线对玻璃的穿透力如何，以及紫外线对有芽孢细菌和无芽孢细菌的灭菌效果差别。

8 细菌的分布 细菌来源 现象 结论 空气 咽喉部 手指（其他） 土壤
接着我们观察并记录空气中细菌、手指细菌、咽喉部、土壤中的细菌在培养基上长出的菌落种类和数量，咽喉部细菌还要观察菌落周围是否有草绿色或透明的溶血圈。庖肉基观察肉汤是否混浊，肉渣是否变色、变碎，石蜡是否离开原位，石蜡与肉汤间是否有气泡，开盖感受产生气体的气味。确定是否有厌氧菌生长。思维根据空气、土壤、人体皮肤和与外界相通的腔道中细菌的分布情况，是否可以得出细菌分布广泛的结论，这对于在医疗实践与某些科学实验中树立无菌观念是否有着重要的意义。

9 diameter 药敏试验：观察细菌在平板上是否长出菌苔及药敏纸片周围是否有抑菌圈，用直尺测定抑菌圈的大小（用毫米做单位，不取小数位）。

10 表1 药敏试验结果读取表 抗菌药物 菌种 纸片含药量 抑菌圈直径（mm） MIC（μg或U/mL） 耐药 中介 敏感 丁胺卡那（阿米卡星） 30μg ≤14 15～16 ≥17 ＞16 ≤16 氨苄青霉素 革兰阴性肠杆菌和肠球菌 10μg ≤11 12～13 ≥14 ≥32 ≤8 葡萄球菌和对青霉素G敏感者 ≤20 21～28 ≥29 ＞32 ≤0.2 嗜血杆菌 ≤19 ～ ≥20 ＞2 ≤2 头孢拉啶（先锋六号） 15～17 ≥18 ≤10 庆大霉素 ≤13 13～14 ≥15 ≥8 ≤4 卡那霉素 14～17 ≥25 ≤6 青霉素G 葡萄球菌 10U ≥0.2 ≤0.1 其他细菌 12～21 ≥22 ≤1.5 链霉素 12～14 四环素 15～18 ≥19 ≥12 万古霉素 ≤9 10～11 ≤5 甲氧西林 金葡菌 5μg 10～13 ≤3 然后与 药敏试验结果读取表 中的测定药物敏感性的标准进行比较，确定药物的敏感性（耐药、中介、敏感）。注意有的药物如青霉素G等对葡萄球菌和其他细菌的敏感性判断标准不同，如青霉素G对葡萄球菌的抑菌圈直径≤20mm为耐药，21-28mm为中介，≥29mm为敏感。而对其他细菌，≤11mm为耐药，12-21mm为中介，≥22mm为敏感。敏感的药物都可用于临床治疗。

11 测定纸片周围的抑菌圈直径并比较大小，其中直径最大的作为化学治疗的首选消毒剂
化学消毒剂抑菌试验 测定纸片周围的抑菌圈直径并比较大小，其中直径最大的作为化学治疗的首选消毒剂 化学消毒剂抑菌试验:测定纸片周围的抑菌圈直径并比较大小，其中直径最大的作为化学治疗的首选消毒剂。

12 实验报告 1、绘图：链球菌、淋球菌，注明革兰染色性 2、记录玻片法血浆凝固酶试验的原理、方法、结果及结论
3、紫外线杀菌试验：比较并记录各区生长现象，分析紫外线的穿透力及对有芽孢和没芽孢细菌的杀灭能力。 4、完成 “细菌的分布 ”的表格内容 5、自己设计表格，记录药敏试验、化学消毒剂抑菌试验结果（包括菌种，药物名称，抑菌圈直径，细菌对抗菌药物的敏感性，选择用于治疗的药物或首选用于治疗的化学消毒剂名称） 那么今天的实验报告有哪些呢？ 1、绘图：包括链球菌、淋球菌，注意注明革兰染色性。 2、记录玻片法血浆凝固酶试验的原理、方法、结果及结论。 3、紫外线杀菌试验：比较并记录各区生长现象，分析紫外线的穿透力及对有芽孢和没芽孢细菌的杀灭能力。 4、完成 “细菌的分布 ”的表格内容。表中结论是指针对细菌的分布情况，谈其对我们在微生物学试验、外科手术、日常生活中的启示。 5、自己设计表格，记录药敏试验、化学消毒剂抑菌试验结果（包括菌种，药物名称，抑菌圈直径，细菌对抗菌药物的敏感性，选择用于治疗的药物或首选用于治疗的化学消毒剂名称）

13 肠道未知标本的检测 将粪拭子接种到S-S平板上，37℃培养18-24小时
1. 涂粪便材料于平板边缘部。 2. 烧灼接种环，冷却后取平板边缘部材料连续划平行线，注意不要与刚才涂抹的区域再接触。 3. 烧灼接种环，冷却后划平行线垂直交叉于第一次线上。 4. 烧灼接种环，冷却后划斜线。 5.烧灼接种环，冷却后与步骤4中斜线垂直方向划斜线。