医学免疫学实验 牡丹江医学院 病原生物学教研室.

Presentation on theme: "医学免疫学实验 牡丹江医学院 病原生物学教研室."— Presentation transcript:

1 医学免疫学实验 牡丹江医学院 病原生物学教研室

2 实验须知 一、医学免疫学实验目的和要求 目的： 1．掌握免疫学的基本实验方法和技术操作。
实验须知 一、医学免疫学实验目的和要求 目的： 1．掌握免疫学的基本实验方法和技术操作。 2．通过实验设计和实验结果的分析，使学生掌握科学的思维方法，培养其独立分析问题和解决问题的能力，提高独立工作的能力。 要求： l．每次实验课前必须做好预习，明确实验目的、原理、方法及操作中的注意事项，避免和减少发生错误。 2．实验过程中必须持严肃认真的态度。 3．对实验结果必须进行仔细地观察和真实地记录，然后进行科学地分析，得出恰当结论。 4．独立认真完成实验报告，书写要字迹清楚，语言简练,表格清晰，画图应力求反应实物标本的原状。 5．切实遵守实验室规则。

3 二、实验室规则 1．进实验室必须穿白服、戴白帽，随身只许带必要的教材、实验指导、笔记本和文具等，但要置于距操作部位远离的位置。
2．实验操作应严格遵照实验指导和教师的讲授进行，以期获得正确结果. 3.实验室内不准高声谈笑、吸烟、饮食、用嘴湿润铅笔和标签等. 4.实验用过的带有传染性物质的吸管、玻片等应放在指定的消毒筒内，待消毒或废弃的物品必须放在指定地点。 5.如发生有传染性的材料污染桌面、地板、书和衣物等时，应立即报告老师，以便及时处置。

4 6. 如将活菌碰到手上，应将手浸入来苏儿中5-10分钟，然后用自来水冲洗，如将菌液吸入口内，应立即吐出，再用0
6.如将活菌碰到手上，应将手浸入来苏儿中5-10分钟，然后用自来水冲洗，如将菌液吸入口内，应立即吐出，再用0.1%高锰酸钾液漱口，必要时服用药物以资预防。 7.要爱护器材，如有损坏，必须报告老师，并在破损登记薄上登记，听候处理。 8.实验结束后，将实验台整理好，检查水、电，防止事故发生，实验材料不准带出实验室。 9.离开实验室前脱下白服，整理好，用消毒液或肥皂洗手后方可离开。

5 免疫学实验课要求 不许迟到、早退;请假必须由系办签字 不允许擅自窜教室，最后无成绩者后果自负 穿白大衣 按时提交实验报告
爱护实验器材（用后用水冲洗后放入指定地点），损坏者按价赔偿 课后认真打扫教室卫生（擦地面和桌面） 关掉手机

6 实验报告 1.实验题目 2.实验目的 3.实验原理 4.实验材料 5.实验方法 6.实验结果与讨论

7 实验一 实验内容 1.直接凝集反应：玻片法、试管法 2.间接凝集反应： 3.间接凝集抑制试验 4.沉淀反应： （1）单向琼脂扩散试验（示教）
（2）双向琼脂扩散扩散试验 （3）对流免疫电泳试验 5.大、小吞噬：标本片

8 凝集反应 凝集反应(agglutination)是经典的血清学反应，它是指颗粒性抗原例如细菌、红细胞等与相应的抗体在适量的电解质存在的条件下，经一定时间后凝聚成肉眼可见的凝集物。参加反应的颗粒性抗原称为凝集原(agglutinogen)，抗体称为凝集素(agglutinin)。 　 根据凝集反应中抗原的性质，反应的方式又分为直接凝集反应(direct agglutination)和间接凝集反应(indirect Or agglutination)。 直接凝集反应有玻片法和试管法之分，而间接凝集反应则分为间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验和协同凝集反应。 由于抗原、抗体结合具有高度的特异性，所以常利用凝集反应协助传染病的诊断、流行病学调查以及微生物分类、遗传研究等诸多方面。

9 实验原理

10

11 直接凝集反应 Direct agglutination
有玻片法和试管法之分. Y +  电解质

12 玻片法--菌种鉴定 实验目的： 1．掌握玻片凝集试验的操作方法，了解其特点和用途。 2．学习玻片凝集试验结果的观察方法。 实验原理
　 玻片凝集试验是一种快速简便的检测方法，即抗原抗体的反应在玻片上进行，是一种定性的试验。一般用已知抗体检测未知抗原，也可用已知抗原检测未知抗体。 　　本试验用已知的伤寒杆菌、痢疾杆菌标准诊断血清鉴定未知细菌。

13 实验材料 1．伤寒杆菌诊断血清、痢疾杆菌诊断血清。 2.菌种：待检菌斜面培养物（伤寒/痢疾）。
3.其他：载玻片、接种环、盛消毒水的容器、记号笔、酒精灯等。

14 实验方法 1．用记号笔在干净的载玻片上均分二格并标明1，2。 2．无菌操作，用接种环分别于一、二格内各加2～3环伤寒杆菌、痢疾杆菌诊断血清。
3．用灭菌接种环自待测菌琼脂斜面上挑取少许细菌置第一格内，搅匀。接种环灭菌后同法取待检菌置于第二格内，混匀。 4．轻轻摇动玻片，1～2分钟后观察玻片凝集现象，记录结果。 观察完毕，将玻片置于盛有消毒液的容器中。

15 实验结果及判定 注意事项 如出现肉眼可见的均匀一致的凝集块者为阳性，仍为均匀一致乳浊液者为阴性。
　　　注意事项 接种环在细菌培养斜面取菌前后均需严格灭菌，以免出现假阳性。

16 　试管法－肥达试验 　　　　实验目的　 1．学习试管凝集反应试验的操作与观察结果的方法。 2．掌握血清凝集效价的定义。

17 实验原理 抗原与不同稀释度的抗体在试管内直接结合而出现的凝集现象称为试管凝集反应。此法是一种定量法，可采用已知抗原(或抗体)来测定人体内相应抗体（或抗原）及其含量(效价或滴度)。 本试验用已知的伤寒杆菌Ｏ、Ｈ抗原测定患者血清中相应抗体，根据凝集现象判断血清凝集效价，协助诊断伤寒、副伤寒。

18 实验材料 1.伤寒杆菌待测免疫血清（1:10）。 2.伤寒杆菌O、Ｈ菌液。 3.生理盐水。 4.小试管：16支/组。
5.其他：1mL、5mL吸管，试管架、吸耳球(或橡皮乳头)、恒温箱、记号笔等。

19 实验方法 1.取16支小试管于试管架上排两排，并用记号笔标明管号。 2.用吸管吸取生理盐水，于各管内各加入0.5ml。
3.用lml吸管吸取伤寒杆菌待测免疫血清，于第1号试管内加入0.5ml，并用此吸管将管内的液体吸放三次，使混合均匀。此时第1号管总体积为lml，稀释度为1：20。

20 4. 从第1号管吸取0. 5mL稀释的免疫血清注入第2管，依上法混匀；再从第2管吸取0
4.从第1号管吸取0.5mL稀释的免疫血清注入第2管，依上法混匀；再从第2管吸取0.5mL注入第3管，依次操作直至第7管，混匀后自第7管吸出0.5mL弃去。第8管不加血清，作为阴性对照，至此，1～7号试管的血清稀释度依次为1:20，1:40，1:80……1:1280。 5.于第一排每管内加入伤寒杆菌O菌液0.5mL ，第二排每管内加入伤寒杆菌Ｈ菌液0.5mL，分别用1支吸管从第8号试管加起，逐个向前加至第1号管。此时，每管总量为lml。第1～7管的血清最终稀释度分别为1:40，1:80，1:160， …… ，1:2560。 6.摇匀，将试管置37℃温箱24小时后取出观察结果。

21 注意事项 1．取样、加样应准确，操作应仔细认真。
2．稀释血清时应小心仔细，以防跳管。若用一支吸管稀释到底，每一试管在加入血清后用吸管吸放三次混匀时，每次吸入吸管的液面高度不能低于上一次，后一试管吸入吸管的液面高度不能低于前一试管的吸入高度，以保证稀释度的准确性。　 3．试管放入试管架及向试管内插放吸管时，动作不可过猛，以免碰破或戳穿试管底。 4．实验完毕，所用的玻璃器皿应消毒灭菌。

22 indirect agglutination
间接凝集反应 indirect agglutination

23 载体颗粒 红细胞（O型人红细胞，羊红细胞及兔红细胞）→间接血凝实验 聚苯乙烯乳胶颗粒→间接乳胶凝集试验 活性碳→间接碳凝集试验

24 间接乳胶凝集试验－－抗 “Ｏ”试验（检测链球菌溶血素“O”）
　　　　　实验目的　 1．学习间接乳胶凝集试验的操作方法及其结果观察方法。 2，了解抗“O”试验的基本原理。

25 实验原理 链球菌感染后2～3周，85％～90％的患者出现抗“O”抗体。所以，检测患者血清中抗“O”抗体的含量可以帮助诊断链球菌感染引起的疾病。 将链球菌溶血素“O”(SO)与羧化聚苯乙烯胶乳化学交联，链球菌溶血素“O”(ASO)高滴度病人血清中和适量的SO后，多余的ASO抗体即与SO致敏的胶乳抗原出现凝集反应，以测定血清中ASO滴度，用于链球菌感染的实验室诊断。

26 实验材料 1．已知抗原：溶血素“O”溶液及溶血素“O”胶乳试剂。 2．待测血清、阳性血清、阴性血清。 3．生理盐水。
4．毛细滴管、刻度吸管、试管、牙签、黑色玻璃反应板。 5 ．注射器、酒精棉球、离心机等。

27 实验方法 1．无菌静脉采血2mL，离心取血清备用。 2 ．将待测血清用生理盐水作1：50；1：80稀释备用。
3．在黑色方格反应板上取四个格，用毛细滴管各加两个稀释倍数的待测血清、阳性血清、阴性血清一滴，然后各格均加一滴溶血素“O”溶液混合，摇动2分钟，最后各格再加溶血素“O”胶乳试剂一滴混合。 4．在黑色反应板上用牙签充分混匀后，连续摇动八分钟观察结果。 实验结果及判定　 阳性对照应出现清晰凝集，阴性对照仍为均匀乳胶状，待测血清如出现清晰凝集者为阳性反应，即抗“O”阳性，反之亦然。

28 间接凝集抑制试验－－ 免疫妊娠试验 实验目的 1．了解直接凝集与间接凝集的区别，间接凝集与间接凝集抑制的区别。
间接凝集抑制试验－－　　　　　 　　　　　免疫妊娠试验 实验目的 1．了解直接凝集与间接凝集的区别，间接凝集与间接凝集抑制的区别。 2．学习间接凝集抑制试验的操作方法。

29 实验原理 可溶性抗原与相应抗体充分作用后再加入已知抗原致敏的载体颗粒，此时因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现载体凝集现象。
临床上常用此试验作早期妊娠检查，具有灵敏、快速之优点。 +

30 免疫妊娠实验： HCG：人绒毛膜促性腺激素

31 实验材料 1.妊娠诊断抗原，为聚苯乙烯乳胶吸附了人类绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）的乳胶颗粒。 2.妊娠诊断抗原，为HCG免疫动物后得到的抗血清。 3. 待检妊娠尿。 4.反应板、滴管、记号笔等。

32 实验方法 实验结果与判定 1.取反应板一块，选取2格，分别加生理盐水、待检尿各一滴。
2.各加一滴妊娠诊断血清，分别混匀，并将玻片连续轻轻摇动半分至1分钟。 3.各加一滴妊娠诊断抗原，分别混匀。 4.将玻片缓慢摇动2～3分钟，并观察结果。 实验结果与判定 出现均匀一致的细小凝集颗粒者为阴性反应，仍为乳状液体者为阳性反应。

33 沉淀反应 沉淀反应(precipitation reaction)是指可溶性抗原(如细菌、外毒素、血清蛋白等)与相应抗体特异性结合后，在一定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和温度)下，经一定时间，于比例合适处形成肉眼可见的沉淀现象。 沉淀反应可分为液体内沉淀反应和凝胶沉淀反应两种类型。 液体内沉淀反应分为环状沉淀反应、絮状沉淀反应和免疫浊度测定等。凝胶沉淀反应又分为琼脂扩散试验、免疫电泳等。 琼脂扩散试验有双向琼脂扩散试验、单向琼脂扩散试验、对流免疫电泳试验 等。

34 琼脂扩散试验 实验目的 1．掌握琼脂扩散试验的基本原理及方法。 2．熟悉琼脂扩散试验的临床应用。

35 单向琼脂扩散试验 （示教） 概念及原理: 应用:
适宜浓度的抗体预先在琼脂中混匀后制成琼脂凝胶板，以适当距离打孔，将可溶性抗原至孔中，抗原向周围扩散，与琼脂中抗体相遇，开始时形成可溶性的抗原－抗体复合物（抗原过量）当更多的抗原到达，与抗体比例适宜时，出现晶格和沉淀。沉淀环的直径与孔中抗原浓度呈正相关，可根据沉淀环直径大小从预先绘制成的标准曲线查出待测标本中抗原含量。本试验方法简单，容易观察结果，可测定抗原的灵敏度约为10～20μg／ml. 应用: 常用于人或动物血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。缺点需要经1～2天结果。

36 材料 1．诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清） 2．待检血清（抗原）：人血清
3．参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。 4．其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。

37 方法 1．将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼 脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。
2．在琼脂板上按一定距离（1.2～1.5厘米）打孔，见图。 3．向孔内滴加1:2，1:4，1:8，1:16，1:32稀释的参考血 清及1:10稀释的待检血清，每孔10微升，此时加入的抗原 液面应与琼脂板一平，不得外溢。 4．已经加样的免疫琼脂板置湿盒 中37℃温箱扩散24小时。 5．测定各孔形成的沉淀环直径(mm), 用参考血清各稀释度测定值绘出标准 曲线，再由标准曲线查出被检血清 中免疫球蛋白的含量。 图单向琼脂扩散试验抗原孔位置示意图 1-5孔加参考血清，6-９孔加待检血清

38 单向琼脂扩散试验

39 双向琼脂扩散试验 原理: 可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周扩散,若两者分子比例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线. 应用: 检测 AFP HBsAg, 协助疾病诊断.

40

41 实验材料 1．待测病人血清1号、2号； 2．阳性对照血清(含AFP) 。 3．抗－AFP诊断血清。 4．琼脂板。
5．其他：加样器、3mm打孔器、模板、湿盒、恒温箱等。

42 实验方法 1．打孔：取琼脂板，放于模板上，用3mm打孔器打孔， 孔间距为5mm(按模板进行)，孔的排列方式如图所示。
2．加样：用微量加样器往中央孔加抗－AFP诊断血清， a、d孔加阳性对照血清，b、f孔加待测病人血清1， c、e孔加待测病人血清2，每孔各加10μl。 3．将琼脂板平放于湿盒内(内放浸有0．5％石炭酸的纱 布以保持相对湿度)，置 37℃温箱中，分别于24 小时观察结果。 　(a) 　 (f) 　 　(b) (A) 　 (e) 　 (c) (d)

43 对流免疫电泳试验 实验目的 了解对流免疫电泳的原理、基本方法及其特点。

44 实验原理 对流免疫电泳又叫反向免疫电泳或免疫电渗电泳。其原理：带电的胶体颗粒可在电场中移动，其移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。在pH8．6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白等电点较高，只带有微弱的负电荷，而且分子较大，所以泳动慢，受电渗作用影响大, 往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向阴极倒退。而抗原通常带有较多的负电荷，分子又小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍然向阳极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时两种成分相对泳动，一定时间后二者相遇，并于比例合适还形成肉眼可见的沉淀线。此种在双向琼脂扩散基础上加电泳的方法，称为对流免疫电泳。 本实验常用于检查血清中抗原如AFP、HbsAg等，也可用于检查抗体效价、抗DNA抗体等的测定。

45 实验材料 1．电泳仪和闭合式电泳槽。 2．pH8．6离子强度0．05M巴比妥缓冲液。 3．琼脂板。 4．已知抗体(AFP诊断血清)。
6．待检血清。 7．其他:模板、打孔器、滤纸、吸管等。

46 实验方法 1.打孔：取琼脂板，放于模板上，用3mm打孔器打孔 (按模板进行)，孔的排列方式如图所示。
2.加样：用微量加样器加样：一侧2孔加抗体，另一侧2孔加待检血清及阳性对照血清。 3.将已加好样的琼脂板放在电泳槽架上(加抗体侧放在阳极),两端贴上已浸透缓冲液的滤纸(至少2层)，滤纸与琼脂板接触部分应在0．4～0．7cm之间，应贴得平整没有气泡。滤纸下端浸入电泳槽内至少2—3cm，切勿使滤纸高接与电极接触。 4.打开电源，调整电压，4～V／cm(玻片长度)，电流3～4mA／cm(玻片宽度)，电泳时间以阳性对照抗原抗体间出现沉淀线后再持续5～10分钟。一般为45～60分钟。 5.调整电压为零，切断电源，取出琼脂板。

47 － ＋ 阳性血清 1 3 抗AFP免疫血清 待检血清 2 3

48 实验结果及判定 待检血清与抗体孔间出现与阳性对照相似的沉淀线，即为AFP阳性，若没有形成沉淀线即为阴性结果。
如抗原量少，沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中，置37℃保温数小时，沉淀线的清晰度有时可得以加强。

49 对流电泳示意图

50 大吞噬：

51 小吞噬