丹参素（danshensu).

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1 丹参素（danshensu)

2 植物来源：唇形科植物丹参 Salvia miltiorrhiza 和甘西鼠尾草的根
丹参酮 丹参素

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4 药理药效： 对心肌的作用 抑制血小板聚集及抗凝作用 抗菌消炎及增强机体免疫作用 抗动脉粥样硬化及降血脂作用 抗血栓形成作用
防止创面的过度愈合，对增生性疤痕的治疗作用 扩张冠状动脉作用 治疗肝损伤的作用 改善神经功能缺损，并减少脑水含量  丹参素对肺心病的治疗 丹参素抗肿瘤作用 丹参素对高原病的防治 丹参素对银屑病的治疗作用

5 生物法合成丹参素策略 Top-down approach Bottom-up approach MIX

6 Top-down approach

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8 rosmarinic acid biosynthesis II
hpaBC wasidentified tobeabletohydroxlylatephenylring in 4-hydroxyphenylacetatein E. coli W strain(XunandSandvik, 2000), whichwasusedtoproduceL-dopa(Munoz, etal.,2011), phenylpropanoicacids(Kang, etal.,2012; Lin andYan,2012) and hydroxytyrosol(Liebgott,etal.,2009) fromL-tyrosine,p-coumaric acid and4-tyrosol,respectively.

9 tyrosine 3-monooxygenase Reaction: 1.14.16.2
使用四氢生物蝶呤(BH4,蝶啶类辅因子)和亚铁离子(Fe2+)作为辅酶

10 rosmarinic acid biosynthesis I

11 3,4-dihydroxyphenylalanine transaminase

12 hydroxyphenylpyruvate reductase(HPPR)
rosmarinic acid(迷迭香酸)代谢路径 It is possible, though not proven, that the reaction product is the R(+)-stereoisomer of 4- or 3,4- hydroxyphenyllactate since the rosmarinic acid only accepts the R(+)-isoforms.

13 tyrosine biosynthesis I

14 Bottom-up approach 苯丙氨酸 1.苯环上的羟化酶（单加或双加） 2.酮基的还原酶 酪氨酸

15 人工合成途径推测 酪氨酸 4-HPP hpaBC tybB d-ldh 丹参素 hpaBC d-ldh
d-ldh 来自植物乳杆菌的D-乳酸脱氢酶 hpaBC 大肠杆菌内源的FAD依赖的4-羟基苯乙酸间位羟化酶 hpaBC tybB d-ldh 丹参素 4-HPP hpaBC d-ldh Yao, Y.-F., et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for production of salvianic acid A via an artificial biosynthetic pathway. Metab. Eng. (2013) (IF:6.859)

16 工程菌构建 丹参素生物合成工程菌 d-ldh和hpaBC共表达载体 L-酪氨酸生产菌株（大肠杆菌）
72h消耗13.7g/L的葡萄糖可以合成7.14g/L的丹参素，转化率达到0.47mol/mol 对比丹参药材提取率为 0.246%

17 问题 1.工业应用的问题： 2.缺乏理论支持： 丹参素为水溶性的溶质，纯化回收难度较大 发酵不稳定，过程不易控制，易生成副产物多巴胺
培养基中添加酵母粉的影响 丹参素生物合成路径未知，设计的路径可能只是一部分合成途径，并非L-酪氨酸一条途径

18 接着推测 苯丙氨酸 丹参素 苯丙酮酸

19 苯丙氨酸羟化酶PAH 使用四氢生物蝶呤(BH4,蝶啶类辅因子)和亚铁离子(Fe2+)作为辅酶的单加氧酶类蛋白质
将苯丙氨酸侧链上的苯环羟基化为酪氨酸

20 对羟基苯甲酸酶 PHBH 4-hydroxybenzoate 3-monooxygenase
需要FAD和NADH、NADPH做辅酶 Pseudomonas fluorescens 物种来源： Pseudomonas fluorescens（PDB中有三维结构ID: 1PDH ） Pseudomonas aeruginosa

21 基因调研 酮基还原酶 苯环上的羟化酶 1. D-ldh 植物乳杆菌 hpaBC 大肠杆菌 2. HPPR 彩叶草 PHBH 荧光假单胞菌

22 MIX tybB L-Tyrosine 4-HPP hpaBC/PHBH hpaBC/PHBH D-ldh/HPPR L-dopa
(R)-3-(4-hydroxyphenyl)lactate 3,4-dihydroxy phenylalanine transaminase hpaBC/PHBH 3,4-dihydroxy phenylpyruvate D-ldh/HPPR danshensu

23 欢迎大家提问！