实验三 马铃薯多酚氧化酶制备 及性质实验.

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1 实验三 马铃薯多酚氧化酶制备 及性质实验

2 【实验预习】 多酚氧化酶是一种含？金属元素的酶 多酚氧化酶的最适底物是？产物的颜色？最大吸收波长？
在多酚氧化酶的制备中，用到NaF溶液的作用是？ 酶催化活性易受各种因素的影响，如( ) 、 ( ) 、 ( ) 、 ( ) 、 ( )以及( )和( ) 等。 在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸和硫脲有什么作用。

3 【实验目的】  学习从组织细胞中制备酶的方法；  掌握多酚氧化酶的作用及各种因素对其作用的影响；

4 【实验原理】 1.多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为6～7。由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。 2. 醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，因此由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。 3. 多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。 4. 酶是生物催化剂，其催化活性易受各种因素的影响，如温度、pH、底物种类、底物浓度、酶浓度以及抑制剂和蛋白质变性剂等都会改变其生物催化活性。

5 【实验仪器与试剂】 仪器： 1．匀浆机（或研钵） 2．小刀，纱布，漏斗，其它玻璃器皿 3．离心机 4．冰箱 5．恒温水浴

6 试剂： 1．马铃薯 2．0.1mol/L的NaF溶液: 将4.2g氟化钠溶于1000mL水中。
3．0.01mol/L的邻苯二酚溶液:将1.1g邻苯二酚溶解于1000mL水中,用稀NaOH调节溶液的pH值为6.0,防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时，应重新配制。新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。 4．pH6.8的磷酸盐缓冲液 5. 5%三氯乙酸溶液 6. 硫脲 mol/L的间苯二酚溶液:将0.11g间苯二酚溶解于100mL水中。 mol/L的对苯二酚溶液:将0.11g对苯二酚溶解于100mL水中。 9．固体硫酸铵 10．0.8％HCl：19.2mL浓HCl加水稀释到1000mL。 11．0.2%和0.3%（V/V）的乳酸溶液。 %的碳酸钠溶液 13．0.01％的碳酸钠溶液

7 【实验方法】 1、多酚氧化酶的制备： 1) 每三个小组一起，称取50g马铃薯（新马铃薯可以不去皮），切块后放入匀浆机，加入150mLNaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。 2)各组分别量取10mL滤液置离心管中，于3500转/min离心5～10min，取上清夜，加入固体硫酸铵～ 4g，溶解，于4℃放置30min，于3500转/min离心15min，倒掉上清液，沉淀用3mL pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，即为粗酶液，含有马铃薯多酚氧化酶。

8 2、多酚氧化酶的催化作用 按表1加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 3、多酚氧化酶的化学性质 按表2加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

9 4、底物专一性 按表3加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。 5、底物浓度的影响 按表4加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

10 6、酶浓度的影响 按表5加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

11 7、氢离子浓度的影响 按表6加入各试剂，观察反应现象并记录和分析原因。

12 【思考题】 1．在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么？ 2．在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸和硫脲有什么作用？
3．该多酚氧化酶的最适pH值是多少？为什么？ 4．通过实验可知哪些因素会影响酶的催化活力？