HPLC日常维护（三） ——流动相.

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1 HPLC日常维护（三） ——流动相

2 一、 液相色谱流动相的性质、要求 理想的液相色谱流动相应具有： 低粘度 与检测器兼容性好 易于得到纯品 毒性低等特征。  

3 注意: 1. k’值是流动相组成的函数 溶剂强度增加 溶质在填料表面的吸附减少 相应的容量因子k’降低 2. 塔板数n一般与流动相的粘度成反比。

4 二、流动相选择原则   ①流动相应不改变填料的任何性质 低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料 有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改 变色谱柱填床的性质。 碱性流动相不能用于硅胶柱系统。 酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附 剂的柱系统。    

5 色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
②纯度 色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。 ③必须与检测器匹配。 使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。 使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。  

6 ④粘度要低（应<2cp） 粘度太高时： 会影响溶质的扩散、传质，降低柱效； 还会使柱压降增加，使分离时间延长； 最好选择沸点在100℃以下的流动相。

7 三、液相色谱流动相的pH值  1.反相离子抑制技术： 采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱 碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的 pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在 固定相上的保留，并改善峰形的技术。

8 对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k’值越大；分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；
分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。 减尾剂（除尾剂）：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。

9 四、液相色谱流动相的选择  在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。
1.正相色谱 在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加； 正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。

10 2. 反相色谱 流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。 极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。 一般情况下，甲醇-水系统是反相色谱最常用的流动相，具有粘度小、价格低的特点。 Snyder推荐采用乙腈-水系统。溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外205nm处检测的要求，但价格较贵。

11 3.梯度洗脱技术 在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k’值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。

12 梯度洗脱（Gradient Elution）
Solvent polarity (composition) continuously varied or stepped 梯度洗脱是指在一个分析周期中，按一定的程序连续改变流动相中溶剂的组成（如溶剂的极性、离子强度、pH值等）和配比，使样品中的各个组分都能在适宜的条件下得到分离。是分析复杂混合物特别是分离保留性能相差较大的混合物的极为重要的手段。

13 优点：改善峰形，提高柱效 缩短分析时间 强保留成分不易残留在柱上 缺点：会引起基线漂移 有时重现性差 故需严格控制梯度洗脱的实验条件。

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16 五、液相色谱流动相的过滤 所有溶剂使用前都必须经0.45μm（或0.22μm）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。 用滤膜过滤时，有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。 对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。

17 所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。
  六、液相色谱流动相的脱气   1.脱气的必要性 所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。 气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。 溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。 溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。  

18 2.溶解氧的危害 （1）对紫外检测器 溶解氧能与甲醇、四氢呋喃等形成有紫外吸收的络合物。 此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低； 会在梯度淋洗时造成基线漂移。

19 （2）对荧光检测器 在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。 （3）对电化学检测器 在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。 （4）除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。

20 3.脱气方法 氦气脱气法 电磁脱气法 超声波脱气法 超声脱气优点：10-20分钟已足够； 不影响溶剂组成。 注意：超声时应避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。

21 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。
七、液相色谱流动相的贮存 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。 （许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染，造成柱效降低。） 贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。   磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在短期内使用完毕。