第九章 碳水化合物的测定 CHARTER 9 Determination of carbohydrates

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1 第九章 碳水化合物的测定 CHARTER 9 Determination of carbohydrates
9.1 概述 9.2 食品中糖类物质的测定方法 9.3 样品的制备 9.4 单糖和低聚糖的测定 9.5 淀粉含量的测定 9.6 纤维素的分析

2 9.1 概 述 碳水化合物是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物，在食品领域统称为糖类物质，是食品的重要组成部分。它们提供的热量占饮食摄入量的70%以上，是人体能量的主要来源，并可转化为脂肪，参与人体生理代谢过程。 糖+蛋白质→糖蛋白；糖+脂肪→糖脂 碳水化合物存在于各种食品的原料中（特别是植物性原料中），是食品工业的主要原料和辅助材料。

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4 在各种食品中存在形式和含量不一。碳水化合物包括单糖、双糖、多糖。其中单糖是糖的基本组成单位。单糖有葡萄糖、果糖和半乳糖；低聚糖有蔗糖、乳糖、麦芽糖等；多糖有淀粉、纤维素等。
有效碳水化合物—人体能消化利用的单糖、双糖、多糖中的淀粉。 无效碳水化合物（膳食纤维等）—多糖中的纤维素、半纤维素、果胶等不能被人体消化利用。但这些无效碳水化合物能促进肠道蠕动，有益于人体健康。

5 糖的性质 ☆ 糖的显色反应 单糖与浓盐酸或浓硫酸作用，脱去三分子水生成糠醛。与某些物质反应显现颜色。 ☆ 还原性
☆ 糖的显色反应 单糖与浓盐酸或浓硫酸作用，脱去三分子水生成糠醛。与某些物质反应显现颜色。 ☆ 还原性 一些低分子糖具有还原性（蔗糖没有还原性，因为蔗糖没有半缩醛羟基）

6 在食品生产和科学研究中，定性、定量测定各种碳水化合物是必要的。
在许多食品包装标签中须要标明出糖、增稠剂（食用胶）、淀粉的含量等； 在食品加工工艺中糖类对改变食品的形态、组织结构、理化性质及色、香、味等感官指标起着十分重要的作用； 在营养配餐中，需测定各种食品的成分，如碳水化合物含量。食品中所含糖的种类和含量在一定程度上标志其营养价值的高低； 蜂蜜掺假的检测中，需进行糖品种的测定； 营养学中“总糖”包括单糖、低聚糖和淀粉。而食品生产中常规分析项目“总糖”不包括淀粉。

7 9.2 食品中糖类物质的测定方法 物理法 物理法 化学法 色质谱法 酶 法 酶 法 重量法 相对密度法 折光法 旋光法  -半乳糖脱氢酶
酶 法  -淀粉酶 葡萄糖氧化酶 测定膳食纤维、果胶

8 直接滴定法 (改良的蓝—爱农法） 高锰酸钾法 萨氏法 3,5-二硝基水杨酸法 苯酚—硫酸法(总糖) 蒽酮法(总糖) 半胱氨酸—咔唑法
还原糖法 化学法 碘量法（醛糖） 比色法

9 纸色谱 薄层色谱 GC（需要衍生） LC(HPLC-DRD/ELSD/PAD、IEC) 色谱法 质谱法（MALDI-TOF/MS）

10 9.3 样品的制备 可溶性糖类的测定通常采用水、乙醇来做提取剂。 弃掉 单糖和双糖的样品制备和提取方法示意图

11 食品原料和产品构成是非常复杂的，其含有的各种组分很有可能对单糖和低聚糖的测定造成干扰，因此，测定时首先要对含脂样品进行脱脂处理，然后采用80%热乙醇溶液对待测样品进行萃取。如果食品原料或产品太酸，如低pH值的果汁，则在萃取前有必要进行中和以防止蔗糖水解。80%乙醇萃取物除了碳水化合物外，还有灰分、色素、有机酸，还可能会含有游离氨基酸和小分子多肽。由于单糖和低聚糖是中性的，而杂质则带有电荷，因此可用离子交换色谱法去除。

12 9.4 单糖和低聚糖的测定 食品原料和产品构成是非常复杂的，其含有的各种组分很有可能对单糖和低聚糖的测定造成干扰，因此，测定时首先要对含脂样品进行脱脂处理，然后采用80%热乙醇溶液对待测样品进行萃取。如果食品原料或产品太酸，如低pH值的果汁，则在萃取前有必要进行中和以防止蔗糖水解。80%乙醇萃取物除了碳水化合物外，还有灰分、色素、有机酸，还可能会含有游离氨基酸和小分子多肽。由于单糖和低聚糖是中性的，而杂质则带有电荷，因此可用离子交换色谱法去除。

13 9.4.1 还原糖的测定 食品中还原性糖有葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等。 测定方法： 直接滴定法 KMnO4法 萨氏法 蓝-爱农法

14 依据GB/T 食品中还原糖的测定 第一法：直接滴定法（碱性铜盐法） 第二法：高锰酸钾滴定法 葡萄糖化学分子结构式

15 依据GB/T 食品中还原糖的测定 第一法：直接滴定法（碱性铜盐法） 原理：将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀；这种沉淀很快与酒石酸钾反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀；这种沉淀与亚铁氰化钾络合成可溶的无色络合物；二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由兰色变为无色，即为滴定终点；根据样液消耗量可计算出还原糖含量。

16 ② 碱性酒石酸铜乙液：酒石酸钾钠 + NaOH + 亚 铁氰化钾； ③ 乙酸锌溶液 ④ 亚铁氰化钾溶液
试剂说明： ① 碱性酒石酸铜甲液：硫酸铜+次甲基蓝； ② 碱性酒石酸铜乙液：酒石酸钾钠 + NaOH + 亚 铁氰化钾； ③ 乙酸锌溶液 ④ 亚铁氰化钾溶液 ⑤ 葡萄糖标准溶液：准确称取经 98 ～ 100 ℃ 干 燥至恒重的无水葡萄糖，加水溶解后移入 1000mL容量瓶中，加入5mL盐酸(防止微生物 生长)。 澄清剂

17 直 接 滴 定 法 ①碱性酒石酸铜溶液中反应 ②天蓝色↓→深蓝色络合物 ③还原糖被氧化成醛酸 + 6 + + 氧化型：蓝色
CHO (CHOH)4 CH2OH + 6 COOK COONa Cu H2O COOH +3Cu2O + + 氧化型：蓝色 终点指示剂：次甲基蓝 还原型：无色 蓝色

18 测 定 方 法 样品处理 静置 碱性酒石酸铜溶液的标定 + + + 弃初滤液，收集滤液备用 过滤 10ml 甲液 乙液 水10ml
提取液 + 5 mL乙酸锌 静置 弃初滤液，收集滤液备用 过滤 碱性酒石酸铜溶液的标定 10ml 甲液 + 乙液 + 水10ml 滴加少量葡萄糖标准溶液 在2min内加热沸腾 继续滴加葡萄糖标准溶液直至溶液蓝色刚好褪去 记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积

19 样品溶液预测(0.1%) 样品溶液测定 记录样品溶液消耗的体积。 方法同上 滴加比预测时样品溶液消耗总体积少1mL的样品溶液 甲液 + 乙液
在2min内加热沸腾 继续滴加至溶液蓝色刚好褪去 记录样品溶液消耗的体积。 样品溶液测定 方法同上

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21 注意事项 本方法测定的是一类具有还原性质的总糖，包括葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等，只是结果用葡萄糖或其他转化糖的方式表示，所以不能误解为还原糖=葡萄糖或其他糖。但如果已知样品中只含有某一种糖，如乳制品中的乳糖，则可以认为还原糖=某糖。 本法又称快速法，它是在蓝一爱农容量法基础上发展起来的，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显。 适用于各类食品中还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。

22 在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2+，得到错误的结果。
碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。 滴定必须在沸腾条件下进行，其原因一是可以加快还原糖与Cu2+的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。 滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。

23 样品溶液预测的目的；一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求(0
样品溶液预测的目的；一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求(0.1%左右)，测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在 10 mL 左右；二是通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少 1 mL左右的样液，只留下 1 mL左右样液在续滴定时加入，以保证在 1 min内完成续滴定工作，提高测定的准确度。 影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度。反应液的碱度直接影响二价铜与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定结果。

24 在一定范围内，溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快。因此，必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。
热源一般采用 800 W电炉，电炉温度恒定后才能加热，热源强度应控制在使反应液在2min内沸腾，且应保持一致。否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。 沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大,一般沸腾时间短，消耗糖液多。反之，消耗糖液少；滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控制上述实验条件，应力求一致。平行试验样液消耗量相差不应超过0.1mL。

25 依据GB/T 食品中还原糖的测定 第二法：高锰酸钾滴定法 原理：试样经除去蛋白质后，其中还原糖把铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量，计算氧化亚铜含量，再查表得还原糖量。

26 9.4.2 蔗糖的测定 蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，无还原性。测定方法如下：
对于纯度较高的蔗糖溶液，可采用相对密度、折射率的物理法进行测定； 酸水解法(GB/T 第二法) 用碱性酒石酸铜标准溶液滴定； 高效液相色谱法测定 依据GB/T 食品中蔗糖的测定（第一法）。 蔗糖化学分子结构式 蔗糖化学分子3D结构式

27 样品溶液的制备： 称取2~10克试样，精确至0.001克，加30毫升水溶解，移至100毫升容量瓶中，加硫酸铜溶液（70克/升）10毫升，氢氧化钠溶液（40克/升） 4毫升，振摇，加水至刻度，静止半小时，过滤。取3~7毫升试液置于10毫升容量瓶中，用乙腈定容。通过0.45微米滤膜过滤，滤液上机测定。

28 蔗糖HPLC分离色谱图 色谱柱：氨基柱（4.6×250mm，5m）； 流动相：乙腈/水（75+25）； 流速：1.0ml/min;
检测器：示差检测器（40℃）； 进样量：10 L（进样浓度10000mg/L）。

29 9.4.3 糖的同时测定 现代的色谱、色谱质谱联用技术可以对单糖、双糖同时进行测定： HPLC-DRD法
Waters NH2色谱柱(250mm×4. 6mm)，乙睛:水 85:15 (V/V)为流动相，流速1.0 mL/min，示差折光检测器，40℃柱温，进样量10L，外标法定量。该方法的精密度RSD＜5%，回收率大于97%。在此色谱条件下20min内完成了单糖、双糖的分离，适用于多数食品中单糖、双糖的测定。

30 HPLC-ELSD法 NH2色谱柱，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，蒸发光散射检测器检测，13种糖（木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇）在0.1-5g/L内均具有良好的线性关系，检出限均在0.1 g/L以下，精密度(RSD)为 %，回收率为 %。用于实际样品检测，结果显示食品标签明示和实际成分相差较大。

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32 离子色谱法

33 高效液相色谱三重四极杆质谱联用法 Waters 糖分析色谱柱，乙睛:水 85:15 (V/V)为流动相，流速1.0 mL/min，质谱检测器，40℃柱温，进样量10L，外标法定量。 MS条件：离子源 APCI，负离子扫描。多反应监测，干燥气氮气，干燥气温度：325 ℃。

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35 9.4.4 碳水化合物总量（总糖）的测定 食品中的总糖通常是指具有还原性的糖(葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等)和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖的总量。 苯酚-硫酸法（国际上通用方法） 原理：是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙红色化合物（最大吸收峰490nm），再用比色法测定。在10~100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比。

36 蒽酮法 原理：单糖类遇浓硫酸时，脱水生成糠醛衍生物，后者可与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物，吸收峰为620nm，当糖的量在20-200mg范围内时，其呈色强度与溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。

37 9.5 淀粉含量的测定 淀粉（starch）是一种多糖（通式为(C6H10O5)n）。它广泛存在于植物的根、茎、叶、种子等组织中，是人类食物的重要组成部分，也是供给人体热能的主要来源。淀粉是由葡萄糖单位构成的聚合体，按聚合形式不同，可形成两种不同的淀粉分子—直链淀粉和支链淀粉。 水溶性：直链淀粉不溶于冷水，可溶于热水，支链淀粉常压下不溶于水。只有在加热并加压时才能溶解于水。 醇溶性：不溶于浓度在30％以上的乙醇溶液。 水解性：在酸或酶的作用下可以水解，最终产物是葡萄糖。 旋光性：淀粉水溶液具有右旋性。 直链淀粉与碘有呈蓝色反应（是碘量法的专属指示剂）

38 直链淀粉的分子结构式 支链淀粉的分子结构式

39 稳定剂—雪糕、冷饮食品 增稠剂—肉罐头 胶体生成剂 保湿剂 乳化剂 粘合剂 填充料—糖果 淀粉的作用 淀粉的作用 酶水解法 酸水解法 旋光法
淀粉也是一种食品添加剂 稳定剂—雪糕、冷饮食品 增稠剂—肉罐头 胶体生成剂 保湿剂 乳化剂 粘合剂 填充料—糖果 淀粉的作用 淀粉的作用 酶水解法 酸水解法 旋光法 酸化酒精沉淀法 淀粉的测定方法 依据GB/T 食品中淀粉的测定

40 酶水解法 样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，在淀粉酶的作用下，使淀粉水解为麦芽糖和低分子的糊精，再用盐酸进一步水解为葡萄糖。最后按还原糖测定，并折算成淀粉含量。 淀粉 蓝糊精 红糊精 麦芽糖 葡萄糖 碘液检验酶解终点

41 ★ 因为淀粉酶有严格的选择性，它只水解淀粉而不会水解其他多糖，水解后通过过滤可除去其他多糖，所以该法不受半纤维素、多缩戊糖、果胶质等其他多糖的干扰，适用于多糖含量较高的样品，分析结果准确可靠，但操作复杂费时。

42 酸水解法 样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，其中淀粉用酸水解成具有还原性的单糖，然后按还原糖测定，并折算成淀粉。
★ 此法操作简单，但选择性和准确性不够高。适用于淀粉含量较高，而半纤维素和多缩戊糖等其他多糖含量较少的样品。对富含半纤维素、多缩戊糖及果胶质的样品，因水解时可生成木糖、阿拉伯糖等还原糖，会导致测定结果偏高。

43 9.6 纤维素的分析 纤维素是地球上最丰富的有机物质，是构成植物细胞壁的主要成分，与淀粉一样，也是由D-葡萄糖构成的多糖，所不同的是，纤维素是由以 -1,4-糖苷键连接而成，分子不分支。纤维素的水解比淀粉困难的多，它对稀酸、稀碱相当稳定，只与浓酸共热时才水解成葡萄糖。聚合度通常为300~2500，相对分子质量为50000~405000。

44 粗纤维—主要成分是纤维素、半纤维素、木质素及少量含N物。集中存在于谷类的麸、糠、秸杆、果蔬的表皮等处。对稀酸、稀碱难溶，人体不能消化利用的部分。
膳食纤维(DF) —不能被人体小肠消化吸收但具有健康意义的（有助于胃肠蠕动）、植物中天然存在或通过提取/合成的、聚合度DP≥3的碳水化合物聚合物。包括纤维素、半纤维素、果胶及其他单体成分等。 可溶性膳食纤维(SDF) —能溶于水的膳食纤维部分，包括低聚糖和部分不能消化的多聚糖等。 不溶性膳食纤维(IDF) —不能溶于水的膳食纤维部分，包括木质素、纤维素、部分半纤维素等。 总膳食纤维(TDF) —可溶性膳食纤维与不溶性膳食纤维之和。

45 样 品 粗纤维的测定 氢氧化钾处理 酸处理 灰 化 酸碱处理称量法（GB/T 5009.10） 乙 醇 和 醚 处 理
原理：在热硫酸(1.25%，煮沸30min)作用下，植物源食品中的糖、淀粉、果胶质和半纤维素经水解除去后，再用热氢氧化钾（1.25%，煮沸30min）处理，除去蛋白质及脂肪酸，剩余的残渣为粗纤维（必要时用乙醇和乙醚处理以除去单宁、色素及残余的脂肪）。如其中含有不溶于酸碱的杂质，可灰化后扣除。 样 品 糖、淀粉、 果胶等物质 单宁 色素 脂肪 无机物质 蛋 白 质 纤维 氢氧化钾处理 乙 醇 和 醚 处 理 酸处理 灰 化

46 膳食纤维的测定 注意问题 试样充分混合均匀，过粗或过细均不好； 严格控制酸、碱处理过程，确保结果的准确性；
恒重要求：烘干质量<1mg，灰化质量<0.5mg； 经过酸碱处理，大部分膳食纤维都丢失，测得的数值仅为膳食纤维总量的20～50%。 膳食纤维的测定 酶重量法（GB/T ） 原理：干燥试样经热稳定 -淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解消化去除蛋白质和淀粉后，经乙醇沉淀、抽滤，残渣用乙醇和丙酮洗涤，干燥称量，即为总膳食纤维残渣。

47 另取试样同样酶解，直接抽滤并用热水洗涤，残渣干燥称量，即得不溶性膳食纤维残渣；滤液用4倍体积的乙醇沉淀、抽滤、干燥称量，得可溶性膳食纤维残渣。扣除各类膳食纤维残渣中相应的蛋白质、灰分和试剂空白含量，即可计算出试样中总的、不溶性和可溶性膳食纤维含量。 该标准测定的总膳食纤维为不能被-淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解的碳水化合物聚合物，包括不溶性膳食纤维和能被乙醇沉淀的高分子质量可溶性膳食纤维，如纤维素、半纤维素、木质素、果胶、部分回生淀粉，及其他非淀粉多糖和美拉德反应产物等；不包括低分子质量(聚合度3~12 )的可溶性膳食纤维，如低聚果糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖、抗性麦芽糊精，以及抗性淀粉等。

48 膳食纤维素测定仪 纤维素测定仪

49 食品分析实验 饼干中蔗糖的测定

50 复习思考题 营养学中“总糖”的概念与食品生产中常规分析项目“总糖”有何不同？ 简述采用现代仪器分析方法测定糖类物质的优缺点。
简述酸水解法和酶水解法测定淀粉的各自优缺点和适用分析对象。 何谓粗纤维、膳食纤维，简述其测定的原理。