学时 32 指导老师：文国琴 西华师范大学生命科学学院

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1 学时 32 指导老师：文国琴 西华师范大学生命科学学院
生物化学实验 学时 32 指导老师：文国琴 西华师范大学生命科学学院

2 时间安排： 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周 第7周 实验1玻璃仪器清洗及使用 实验3 纸层析分离鉴定氨基酸
实验3　纸层析分离鉴定氨基酸 实验7 蛋白质的两性解离与等电点测定 实验10　 酶的专一性 实验14 血糖的定量测定—邻甲苯胺法 实验15 DNA的提取 实验4　蛋白质、氨基酸的茚三酮反应 实验8 蛋白质的沉淀反应 实验11 温度对酶活力的影响 实验2 实验室常见仪器的使用 实验5　蛋白质的双缩脲反应 实验9　血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 实验12 pH对酶活力的影响 实验16　DNA的电泳分析 实验6　蛋白质的黄色反应 实验13 唾液淀粉酶的活化与抑制 2015秋 生物化学实验 文国琴

3 实验1 玻璃仪器清洗及使用 一、实验室规则及安全、卫生教育 实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点： 2015秋 生物化学实验 文国琴

4 1、每次实验前必须详细预习实验讲义，明确实验原理及操作步骤，并在记录本上拟出操作时的注意事项。
2、实验时自觉遵守课堂纪律，严格按操作规程操作，既要独立操作又要与其他同学配合。 3、实验时应严格按照实验步骤及试剂用量进行操作，不能任意变更。不熟悉的仪器和设备，应先请老师讲解后使用，切勿随意乱动。 2015秋 生物化学实验 文国琴

5 4、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成作原始记录的良好习惯。
5、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问题的办法。 6、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后方可补领，并按规定赔偿。 2015秋 生物化学实验 文国琴

6 7、精密贵重仪器每次使用后应登记姓名并记录仪器使用情况。要随时保持仪器的清洁。如发生故障，应立即停止使用并报告指导教师。
8、实验中所用得玻璃仪器及其它器皿，应洗涤干净，桌面、地面要保持清洁有序，实验完毕后，所用仪器设备应恢复原状。 9、实验过程中要听从老师指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教师检查签字同意，方可离开实验室。 2015秋 生物化学实验 文国琴

7 10、必须遵守实验室规则： （1）室内不得高声谈笑，保持安静的实验环境。
（2）爱护仪器，不得浪费药品，节省水电，遵守学生守则及实验室安全、卫生等制度。 （3）公用仪器及试剂瓶用完后应及不要移动原有的位置。注意瓶塞切勿盖错，以免污染试剂，用毕后立即放回原处。对于有害药品，应按实验室规定取用。 （4）滤纸、火柴棒、碎玻璃等应投入废品袋，切勿丢入水池，以保证下水道畅通。 2015秋 生物化学实验 文国琴

8 （5）如用仪器有损坏，立即向指导老师报告，再行登记。
（6）保持实验室的整齐清洁，个人所带与实验无关的东西，如书包等要放在实验室指定地方，不得乱放在实验桌上。 （7）由学生轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和服务性的工作，特别注意打扫水槽中废弃物。 （8）最后一组实验人员，离开实验室时，检查水、电、门、窗是否关闭，以保证实验室安全。 （9）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。 2015秋 生物化学实验 文国琴

9 二、生物化学实验基本操作 一. 玻璃仪器的洗涤
在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。 ㈠ 常用的洗涤方法： 1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、洗衣粉、合成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。 2015秋 生物化学实验 文国琴

10 （2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。
2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上； （2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。 2015秋 生物化学实验 文国琴

11 3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法： （1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；
（2）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗； （3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4~6小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次。 2015秋 生物化学实验 文国琴

12 4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3次。
5.凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。 2015秋 生物化学实验 文国琴

13 ㈡ 使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意以下几点：
1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。 2.Hg2+、Ba2+、Pb2+等离子可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或5~10%EDTA钠清除）。 3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。 2015秋 生物化学实验 文国琴

14 4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。
5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液。因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。 2015秋 生物化学实验 文国琴

15 重铬酸钾洗液的配制: 取重铬酸钾20g溶于20ml蒸馏水中，加热至沸。冷却后再将200ml浓硫酸慢慢加入，边加边搅拌。
注意：此时可产生高热。为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。 为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释变质，洗液应贮存于带盖的容器中。当清洁效力降低时，再加入少量重铬酸钾及浓硫酸就可继续使用。 2015秋 生物化学实验 文国琴

16 二. 吸量管的使用 吸量管和定量吸(移)液器(微量加样器)均为用来转移一定体积溶液的量器。
㈠ 吸量管：生化实验中常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。 1.刻度吸量管： ⑴刻度吸量管的种类： 2015秋 生物化学实验 文国琴

17 ①按容量规格来分，有0. 1、0. 2、0. 25、0. 5、1、2、5、10ml等数种。其精密度按不同的容积可达移取量的0
①按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等数种。其精密度按不同的容积可达移取量的0.1~1%。通常将管身标明的总容量分刻为100等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其余类推。 2015秋 生物化学实验 文国琴

18 ②按“零”点位置来分，有“O”点在吸量管上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有“O”点在吸量管下端的（读数从下而上逐渐增大)。两种标示方法，在使用时各有方便之处。
③按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体(我实验室的刻度吸量管全部是这一种)，另一种是刻度不刻到尖端的。 2015秋 生物化学实验 文国琴

19 ⑵刻度吸量管的正确使用方法： 用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。然后将吸量管插到需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。 2015秋 生物化学实验 文国琴

20 ①选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积（ml数）。
⑶使用刻度吸量管的注意事项： ①选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积（ml数）。 ②仔细看清吸量管的刻度情况：刻度是否包括吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还是从下而上？ ③拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数。 2015秋 生物化学实验 文国琴

21 ⑤按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。
④吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部(以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球)，三是使用洗耳球(不可直接用口吸)。 ⑤按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。 2015秋 生物化学实验 文国琴

22 ⑦使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。
⑥吸取粘滞性大的液体(如血液、血浆、血清等)时，除选用合适的吸管(奥氏管)外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度(用食指压力控制)，待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。 ⑦使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。 2015秋 生物化学实验 文国琴

23 3.奥氏吸量管：准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。
2.移液吸量管：也有两种，常见的一种是吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。无论哪一种，在使用时将量取的液体放出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端的液体。 3.奥氏吸量管：准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。 2015秋 生物化学实验 文国琴

24 ㈡ 定量吸(移)液器(微量加样器)：定量吸液器是吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。
1.定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸嘴即可）。 2015秋 生物化学实验 文国琴

25 2.定量吸液器的类型：有两种类型。 ⑴固定式：只能取加一定容量的试剂，不能随意调节取加样量。其规格有10μl、20μl、25μl、30μl、50μl、100μl、200μl、250μl、300μl、400μl、500μl、1000μl等。 2015秋 生物化学实验 文国琴

26 （2）可调式 能取加一定容量的试剂，可调节取加样量。其规格有0.2-2ul、2-20ul、10-100ul、20-200ul、 ul、 ul、 uL 2015秋 生物化学实验 文国琴

27 实验2 实验室常见仪器的使用 离心机的使用： 平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停 分光光度计 机器原理和测定原理（比尔定律） 水浴锅的使用
实验2 实验室常见仪器的使用 离心机的使用： 平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停 分光光度计 机器原理和测定原理（比尔定律） 水浴锅的使用 电子天平的使用 2015秋 生物化学实验 文国琴

28 实验3　纸层析分离鉴定氨基酸 一、实验目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法 2015秋 生物化学实验 文国琴

29 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。(其原理详参见P2）
层析溶剂由有机溶剂(或称有机相，是流动的、被水饱和的，构成流动相)和水(通常是被结合在滤纸上，构成固定相)组成。 2015秋 生物化学实验 文国琴

30 纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相，由于纤维素与水的氢键作用，使水不易扩散，并能与跟水混合的溶剂(有机相)形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 2015秋 生物化学实验 文国琴

31 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（迁移率）来表示的：
原点到层析点中心的距离 Rf＝ 　　　　 原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量、展层方式、层析温度和pH等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 2015秋 生物化学实验 文国琴

32 1、器材：层析缸（或标本缸），毛细管，喷雾器，电吹风，培养皿，层析滤纸(质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。）
三、器材及试剂 1、器材：层析缸（或标本缸），毛细管，喷雾器，电吹风，培养皿，层析滤纸(质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。） 2、试剂：0.5%的赖氨酸，0.5%的脯氨酸，0.5%的缬氨酸，0.5%的苯丙氨酸，0.5%的混合氨基酸，显色剂（ 0.1%茚三酮-正丁醇溶液），扩展剂（正丁醇：醋酸：水 4：1：3 （v:v） ） 2015秋 生物化学实验 文国琴

33 1．取扩展剂约5ml置于培养皿中，将其置于密闭的层析缸中。
四、实验步骤 1．取扩展剂约5ml置于培养皿中，将其置于密闭的层析缸中。 2．取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2-3cm 处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm 作一个记号(“×”型而不是“.”型)，共作5个记号作为点样点；另外，沿展层方向在滤纸两边距边缘约0.5-1cm处对称地划两条直线，分别将其四等分，各取其三个等分点作为缝线点。 2015秋 生物化学实验 文国琴

34 用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这5个点样点位置上(注意速度要快，否则易扩散开)，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。
3、点样 用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这5个点样点位置上(注意速度要快，否则易扩散开)，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。 4．扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触，将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需要低于点样纸1cm）。待溶剂上升15-20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或者用吹风机吹干。 2015秋 生物化学实验 文国琴

35 5．显色 用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用热风吹干即可以显出个层析斑点。
5．显色 用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用热风吹干即可以显出个层析斑点。 6．计算各种氨基酸的Rf值 五、实验结果记录 2015秋 生物化学实验 文国琴

36 六、思考题： 1．何谓纸层析法？ 2．何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 3．怎样制备扩展剂？ 七、实验注意事项
2015秋 生物化学实验 文国琴

37 实验4 蛋白质、氨基酸的双缩脲反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
实验4　蛋白质、氨基酸的双缩脲反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 2015秋 生物化学实验 文国琴

38 双缩脲反应:尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，能发生双缩脲反应。这可用于蛋白质的定性或定量测定。 2015秋 生物化学实验 文国琴

39 2015秋 生物化学实验 文国琴

40 ②NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子( Cu(NH3)42+ ，四氨合铜)。
注意:①双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所特有，许多含有一个肽键和一个氨基的物质也能发生此反应 如 –CS-NH2，-CH2-NH2，O=C C=O 等。 NH2 NH2 ②NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子( Cu(NH3)42+ ，四氨合铜)。 因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反 应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 2015秋 生物化学实验 文国琴

41 三、器材及试剂 1、器材： 电炉、试管、试管架、吸管、吸管架等 2、试剂： 尿素, 1%CuSO4溶液， 10%NaOH溶液
2%卵清蛋白溶液 2015秋 生物化学实验 文国琴

42 四、实验步骤 取少量尿素结晶于干燥试管中→微火加热熔化→硬化时停止加热→冷后，加10%NaOH溶液约1ml →振荡混匀→加一滴1%CuSO4溶液→再振荡→观察记录 另取一只试管→加卵清蛋白溶液约1ml 和10% NaOH溶液约2ml →摇匀→加1% CuSO4溶液2滴→随加随摇→观察记录 2015秋 生物化学实验 文国琴

43 注意事项： 1、不能加入过量的硫酸铜。为什么？ 2、加热中是关口不能对着同学或自己。 2015秋 生物化学实验 文国琴

44 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 2015秋 生物化学实验 文国琴

45 除脯氨酸，羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
2015秋 生物化学实验 文国琴

46 该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液 即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应 (尿素、 马尿酸和肽键上的亚氨基不呈现此反应。)因此，虽然 蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳 性反应的不一定是蛋白质或氨基酸。在定性定量测定 中，应严防干扰物存在。 该反应十分灵敏，1： 浓度的氨基酸水溶液 即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 (此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基 酸在不同的pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚 至不显色。) 2015秋 生物化学实验 文国琴

47 三、器材及试剂 1、器材： 电炉、试管、试管架、吸管、滤纸等 2、试剂：
10%鸡蛋清溶液，0.5%甘氨酸溶液，0.1%茚三酮水溶液，0.1%茚三酮乙醇溶液 2015秋 生物化学实验 文国琴

48 (1)取两支试管→分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1ml →再各加0.1%茚三酮水溶液0.5ml →混匀→沸水浴中加热1～2分钟→ 观察
(2)在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液 风干 →在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液 微火旁烘干显色→观察 2015秋 生物化学实验 文国琴

49 注意事项： 1、观察颜色的变化过程。 2、含乙醇试剂与不含的一定不要弄错。 2015秋 生物化学实验 文国琴

50 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 2015秋 生物化学实验 文国琴

51 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
(多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，注意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的浓硫酸才有黄色反应，该反应非常灵敏。) 2015秋 生物化学实验 文国琴

52 三、器材及试剂 1、器材： 试管、试管架、吸管、吸管架等 2、试剂：
10%NaOH溶液，大豆提取液，5%鸡蛋清溶液，0.5%苯酚溶液，浓硝酸，0.3%色氨酸、0.3%酪氨酸溶液 2015秋 生物化学实验 文国琴

53 向6支试管中分别按下表加入试剂，观察各试管出现的现象，待各管出现黄色后，与室温下逐滴加入 10%NaOH溶液至碱性，观察颜色变化。
2015秋 生物化学实验 文国琴

54 注意事项： 1、浓硝酸不要滴到桌上或身上、尤其是皮肤 2、加热中是关口不能对着同学或自己。 2015秋 生物化学实验 文国琴

55 实验7 蛋白质的两性解离与 等电点测定 一、实验目的 1、了解蛋白质的两性解离性质； 2、学习测定蛋白质等电点的方法；
实验7 蛋白质的两性解离与 等电点测定 一、实验目的 1、了解蛋白质的两性解离性质； 2、学习测定蛋白质等电点的方法； 2015秋 生物化学实验 文国琴

56 蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡 COOH
P (蛋白质分子) NH2 COO COO COOH P P P NH NH NH3+ 阴离子 兼性离子 阳离子 pH>pI pH=pI pH<pI 电场中： 移向阳极 不移动 移向阴极 + H+ + H+ + OH- + OH- 2015秋 生物化学实验 文国琴

57 蛋白质的等电点(pI) ：~~ 不同蛋白质各有其特异的等电点(pI)。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低(或沉淀量最多)时的溶液pH值。本实验借观察不同pH缓冲液中溶解度以测定酪蛋白的等电点。 2015秋 生物化学实验 文国琴

58 1、器材：水浴锅 温度计 容量瓶 锥形瓶 吸管 试管 吸管架 试管架
三、器材及试剂 1、器材：水浴锅 温度计 容量瓶 锥形瓶 吸管 试管 吸管架 试管架 2、试剂： 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：1.0mol/L 醋酸溶液, 0.1mol/L醋酸溶液，0.01mol/L醋酸溶液 2015秋 生物化学实验 文国琴

59 1、取同样规格的试管4支，按p114表中1，4，5，7试管号顺序分别精确的加入各试剂，然后混匀。(注意：在测定等电点实验中，要求各种试剂的浓度和加入量相当准确)
2015秋 生物化学实验 文国琴

60 2、向以上各试管加酪蛋白的NaAc溶液 1mL(加一管，摇匀一管)。此时1，4，5，7管的pH依次为3. 5，4. 7，5. 1，5
2、向以上各试管加酪蛋白的NaAc溶液 1mL(加一管，摇匀一管)。此时1，4，5，7管的pH依次为3.5，4.7，5.1，5.9。观察其混浊度，用＋、－表示。静置10分钟后，再观察其混浊度(最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点) 2015秋 生物化学实验 文国琴

61 沉淀最多的即为酪蛋白的pI 注意事项：保证试剂的绝对准确！ 2015秋 生物化学实验 文国琴

62 一、实验目的 1、 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义； 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
2015秋 生物化学实验 文国琴

63 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可以分为两类： (1)可逆的沉淀反应(不变性，如盐析作用或低温作用下用乙醇或丙酮短时间作用) (2)不可逆的沉淀反应(变性，如加热沉淀与凝固、与重金属离子或某些有机酸反应等) 2015秋 生物化学实验 文国琴

64 (注意：蛋白质变性后，由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性)
2015秋 生物化学实验 文国琴

65 1、器材：容量瓶 锥形瓶 吸管 试管 吸管架 试管 架 2、试剂：10%鸡蛋清溶液，pH4. 7HAc-NaAc的 缓冲溶液（0
1、器材：容量瓶 锥形瓶 吸管 试管 吸管架 试管 架 2、试剂：10%鸡蛋清溶液，pH4.7HAc-NaAc的 缓冲溶液（0.2mol/L），3%硝酸银溶液，5%三氯乙 酸溶液，乙醇，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵结晶粉末， 0.1mol/L盐酸溶液，0.1mol/L氢氧化钠溶液， 0.05mol/L碳酸钠溶液，甲基红溶液，2%氯化钡溶液 2015秋 生物化学实验 文国琴

66 1、蛋白质的盐析： 2、重金属离子沉淀蛋白质 3、某些有机酸沉淀蛋白质(Ph<pI) 4、有机溶剂沉淀蛋白质(蛋白质脱去水化层，降低介电常数) 5、乙醇引起的变性与沉淀 甲基红的变色范围是PH4.4~6.2： 1).其pH值在4.4~6.2区间时,呈橙色, 2).其pH值<=4.4时,呈红色 3).其pH值>=6.2时,呈黄色 2015秋 生物化学实验 文国琴

67 六、思考题：何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？
五、实验结果记录： 六、思考题：何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？ 注意事项：试剂加入量合适 滴管不得混用 2015秋 生物化学实验 文国琴

68 一、实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术， 了解电泳技术的基本原理 2015秋 生物化学实验 文国琴

69 由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在pH 8
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70 1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及 γ-球蛋白，6为点样原点
以醋酸纤维素薄膜为支持物，血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白（如图）。 图正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及 γ-球蛋白，6为点样原点 2015秋 生物化学实验 文国琴

71 这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。
此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。 2015秋 生物化学实验 文国琴

72 2、试剂：[1]硼酸缓冲液(pH 8.6，0.075mol/l，离子强度0.075，)。
1、器材：[1]醋酸纤维素薄膜(2×8cm)[2]培养皿(直径9—10cm)[3]竹镊子[4]点样器[5]直尺和铅笔[6]电泳仪 [7]电泳槽[8]玻璃板(12×12cm） [9]普通滤纸[10]大号培养皿。 2、试剂：[1]硼酸缓冲液(pH 8.6，0.075mol/l，离子强度0.075，)。 [2]染色液(0.5％氨基黑10B)。 [3]漂洗液 [4]透明液 [5]未溶血的人或动物血清。 2015秋 生物化学实验 文国琴

73 点样:吸干，无光泽面朝上，在膜条一端2-3厘米处点样品。
薄膜浸泡：20分钟 点样:吸干，无光泽面朝上，在膜条一端2-3厘米处点样品。 电泳：点样端在负极,1mA/膜,点样面向下时间60min 染色: 5min 透明：用竹镊子夹起薄膜的一端，放入透明液中，约20s左右夹出贴于玻璃板晾干 漂洗:2次，底色脱净为止 2015秋 生物化学实验 文国琴

74 绘制薄膜上的图样，标明各种蛋白质。 注意事项： 1、浸膜时，小心地平放在缓冲液中，不要有气泡 2、点样时膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，样品有粗度，且均匀，不能过多，不可重复 ， 3、电泳是点样端靠近阴极，点样面朝下 4、电泳时电流，每厘米膜宽电流强度为0.3mA，1h 5、电泳结束，先调节电流为0，再断电 6、透明时，时间应略短，若透明度不够可以用吸管取少量透明液滴上作补救 2015秋 生物化学实验 文国琴

75 实验10 酶的专一性 实验12　pH对酶活力的影响 实验13 唾液淀粉酶的活化与抑制 2015秋 生物化学实验 文国琴

76 蓝色→蓝色、紫色、暗褐色或红色、不呈色→不呈色
＋I2 蓝色→蓝色、紫色、暗褐色或红色、不呈色→不呈色 在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。 2015秋 生物化学实验 文国琴

77 配方为： ①400mL水中加85g柠檬酸钠和50g无水碳酸钠； ②50mL加热的水中加入8
配方为：   ①400mL水中加85g柠檬酸钠和50g无水碳酸钠；   ②50mL加热的水中加入8.5g无水硫酸铜。制成溶液；   ③把溶液倒入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，如产生沉淀可滤去。 可长期保存 2015秋 生物化学实验 文国琴

78 只适用于还原性糖（如葡萄糖）的鉴定，不用于非还原性糖（如蔗糖）的鉴定
柠檬酸钠和碳酸钠均为强碱弱酸盐，在水中它们均可水解产生OH-，与柠檬酸钠-碳酸钠溶液和CuSO4溶液混合时，Cu2+和OH-结合，生成Cu（OH）2，Cu（OH）2与葡萄糖中的醛基反应生成砖红色沉淀。 只适用于还原性糖（如葡萄糖）的鉴定，不用于非还原性糖（如蔗糖）的鉴定 2015秋 生物化学实验 文国琴

79 实验14 血糖的定量测定—邻甲苯胺法 一、实验目的 掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理和方法 2015秋 生物化学实验 文国琴

80 血液中所含的葡萄糖，称为血糖。它是糖在体内的运输形式。目前国内医院多采用葡萄糖氧化酶法和邻甲苯胺法测定血糖。
前者特异性强、价廉、方法简单,其正常值：空腹全血为3.6～5.3毫摩尔/升（65～95毫克/分升），血浆为3.9～6.1毫摩尔/升。后者由于血中绝大部分非糖物质及抗凝剂中的氧化物同时被沉淀下来，因而不易出现假性过高或过低, 结果较可靠, 其正常值：空腹全血为3.3～5.6毫摩尔/升（60～100毫克/分升），血浆为3.9～6.4毫摩尔/升（70～115毫克/分升）。 本实验采用邻甲苯胺法测定血糖。其原理是葡萄糖在酸性介质中加热脱水反应生成5－羟甲基－2－呋喃甲醛，分子中的醛基与邻甲苯胺缩合成青色的薛夫氏碱，通过比色可以定量。 2015秋 生物化学实验 文国琴

81 三、器材及试剂 1. 仪器 （1）具塞试管1.5×15cm（×8）；（2）分光光度计2. 试剂
1.  仪器 （1）具塞试管1.5×15cm（×8）；（2）分光光度计2.  试剂 1）邻甲苯胺试剂：称取硫脲1.5ｇ溶于750ｍL冰醋酸中, 加邻甲苯胺150ｍL及饱和硼酸40ｍL, 混匀后加冰醋酸至1000ｍL, 置棕色瓶中，冰箱保存。 2）葡萄糖标准溶液：5.0mg/mL，临用时稀释成1.0 mg/mL。 2015秋 生物化学实验 文国琴

82 1、制作标准曲线 取6支试管编号后，按下表顺序加入试剂：
管号 标准葡萄糖液(mL)蒸馏水(mL)邻甲苯胺试剂(mL)  0      0.00          0.10         5.0  1      0.02          0.08         5.0  2      0.04          0.06         5.0  3      0.06          0.04         5.0  4      0.08          0.02         5.0  5      0.10          0.00         5.0 2015秋 生物化学实验 文国琴

83 加毕，温和混匀，于沸水浴中煮沸4min取下，冷却，放置30min，用1cm比色杯，试剂空白为参比，测定630nm 处吸光值，绘制标准曲线。
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91 取3支试管编号后，分别加入试剂，与标准曲线同时作比色测定：
管号稀释的未知血清样品(mL) 蒸馏水(mL) 邻甲苯胺试剂(mL)  对照         0                      0.10         5.0  样品①     0.10                   0.00         5.0  样品②     0.10                   0.00         5.0 A630   加毕，温和混匀，于沸水浴中煮沸4min取下，冷却，放置30min，用1cm比色杯，试剂空白为参比，测定630nm 处吸光值，从标准曲线中可查出样品中血糖含量。 2015秋 生物化学实验 文国琴

92 注意事项： 邻苯甲胺法测定血糖具有操作简单,特异性较高的优点, 试剂成本也较低, 目前在教学实验或规模较小的基层医院用于测定血糖。但该法一般在浓酸高温条件下发生反应, 因此在做血糖测定时须多加注意。 2015秋 生物化学实验 文国琴

93 实验15 DNA的提取 一、实验目的 掌握DNA的提取操作方法及原理 2015秋 生物化学实验 文国琴

94 DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。 在DNA提取过程中应做到：1,根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。 2015秋 生物化学实验 文国琴

95 台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、取液器、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统 2. 试剂
三、器材及试剂 1.  仪器 台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、取液器、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统 2.  试剂 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH7.5）； 饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液（loading buffer） 2015秋 生物化学实验 文国琴

96 ④挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,无水乙醇洗涤晾干 ⑤0.2mlTE(或水)＋1ulRNase，65℃,10-30分复溶和除RNA
①0.5g植物组织加入 2ml裂解液(含1/10体积酚),(65℃预热),研磨成匀浆 ②加入等体积氯仿, 65℃放置30分钟，隔5－10min轻摇一次,离心( rpm, 15min )，取上清液 ③加入0.6体积冷异丙醇,0.1体积3MpH5,2乙酸钠,低温4℃静置20min，离心( rpm, 2min ) ④挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,无水乙醇洗涤晾干 ⑤0.2mlTE(或水)＋1ulRNase，65℃,10-30分复溶和除RNA ⑥等体积酚/氯仿,氯仿抽提（轻轻混匀、冰浴沉淀5min，5000RPM离心5min，取上清） ⑦上清液加入2V无水乙醇、1/10VnaAC,-20℃，30min，10000RPM,10min得沉淀 ⑧70%冷乙醇洗涤，无水乙醇洗涤晾干 ⑨加入0.1mlTE或水中, -20℃或4℃保存 2015秋 生物化学实验 文国琴

97 1,裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解 2，酚一定要碱平衡 3,各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解 4,取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰. 5,异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。 6,本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省线的特点。 7,此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取。 2015秋 生物化学实验 文国琴

98 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理
一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。现在我们使用的是EB替代染料，无毒染料。 本实验用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，其主要内容包括制胶，加样，电泳，染色及拍照。 2015秋 生物化学实验 文国琴

99 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器， 2. 试剂 实验14提取的DNA样品，
1.  仪器 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器， 2.  试剂 实验14提取的DNA样品， 三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 2015秋 生物化学实验 文国琴

100 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。
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101 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0. 3-1
2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按 %的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶， bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 2015秋 生物化学实验 文国琴

102 3、灌胶 待琼脂糖溶液冷却到60℃，加入染料，混匀。轻轻倒入电泳槽水平板上。
4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加4-8μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、观察 取出凝胶，放在紫外灯下照相记录电泳图谱。 2015秋 生物化学实验 文国琴

103 2015秋 生物化学实验 文国琴