实验二 植物基因组DNA的提取.

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1 实验二 植物基因组DNA的提取

2 一. 实验目的及背景 高等动物，高等植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有1.4*108个碱基对，水稻基因组有1.4*109个碱基对。真核细胞基因组中，约１－1.5万个可表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的。而研究的起点就是要获得纯度高（不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染）；得率好（以便有足够量用于分析）；基因组相对完整的基因组（无断裂、降解）以便用于以后PCR分析、基因文库的构建、基因探针等的研究。

3 二、实验原理 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ。 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

4 二、实验原理 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

5 三、实验材料 水稻叶片 四、主要试剂 2×CTAB，氯仿，100%无水乙醇，75%乙醇，异丙醇等

6 五、实验步骤 (微量提取) 1 、将叶片置于研钵中，用液氮研磨至粉状 2 、取少量粉末至1.5 ml离心管中（约至0.25ml刻度处）
3 、加入600 µl 2 ×CTAB试剂，轻轻摇动混匀 4 、置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出 5、冷却1 min后，加入600µl氯仿，剧烈振荡混匀 6、放入台式离心机中 rpm离心5 min 7、取400 µl上清液移入一新的1.5ml离心管中，加入3/4体积的异丙醇， 缓慢颠倒混匀，出现的白色絮状物即为基因组DNA 8、放入台式离心机中 rpm离心5 min，去上清（注意勿将DNA沉淀倒出） 9、加入300 µl 75%乙醇轻轻洗涤管壁 10 、放入台式离心机中 rpm离心21min，去上清（注意勿将DNA沉淀倒出） 11 、将离心管倒立于铺开的纸巾上，去乙醇，风干 12、用50 µl TE或双蒸水溶解沉淀DNA，电泳（0.8%）检测，余下的保存于-20℃

7 六、实验结果

8 七、 注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提
液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅 速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶， 使DNA降解。

9 八、思考题 1、本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB，氯仿，异丙醇，75%乙醇 2、提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？