抗微生物药物 敏感试验.

Presentation on theme: "抗微生物药物 敏感试验."— Presentation transcript:

1 抗微生物药物 敏感试验

2 体外抗菌药物敏感试验（antimicrobial susceptibility testing in vitro)主要包括：
1.抑菌试验 2.杀菌试验 3.联合药敏试验 4.检测细菌所产生的抗生素灭活酶

3 1.对其敏感性不能预测的临床分离菌株必须常规进行药敏试验以供临床选择治疗药物时参考。
体外抗菌药物敏感试验的目的： 1.对其敏感性不能预测的临床分离菌株必须常规进行药敏试验以供临床选择治疗药物时参考。 2.临床因治疗的反应差而考虑更换抗菌药物史，应对拟选药物进行药敏试验。

4 3.了解所在医院或地区常见病原菌耐药性的变迁情况，定期通报临床，有助于临床的经验治疗选药
4.评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等药效学特性。 5.对细菌耐药谱进行分析和分型有助于某些菌种的鉴定，并作为医院流行病学调查的手段之一。

5 体外药敏试验的抗菌药物选择： 结合 本单位、本地区常用的抗菌药物 常见病原菌的耐药现状 确定体外药敏试验抗菌药物的品种。

6 抑菌试验 （一）.纸片扩散法 K-B纸片琼脂扩散法 :是目前各国临床微生物实验室广泛采用的标准纸片扩散法。
1）原理 ：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。

7

8 2）K-B法试验程序 挑取菌落 转种肉汤 比浊 涂布平板上 放置药敏纸片 量取抑菌圈大小

9 3）结果判定 用精确度为10mm的游标卡尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域）。 分为三级： 根据NCCLS标准，对量取抑菌圈直径作出“敏感”（susceptible）“耐药”（resistant）和“中度敏感”（intermediate）的判断。 4) 临床意义 是临床上最广泛使用的药敏试验，可用来检测细菌对抗生素的耐药情况。

10 MIC (μg/ml) 抑菌环直径(mm) 抗菌药物和细菌 敏感 中介 耐药 敏感 中介 耐药 青霉素 青霉素G 葡萄球菌 ≤ ≥ ≥ ≤28 肠球菌 ≤ ≥ ≥ ≤14 苯唑西林 金黄色葡萄球菌 ≤ ≥ ≥ ～ ≤10 凝固酶阴性葡萄球菌 ≤ ≥ ≥ ≤17 氨苄西林 肠杆菌 ≤ ≥ ≥ ≤13 葡萄球菌 ≤ ≥ ≥ ≤28 肠球菌 ≤ ≥ ≥ ≤16

11 培养基的质量：MH琼脂、pH(7.2~7.4)、深度（4mm)等。 药敏纸片的质量（直径6.35mm、吸水量20μl)药含量 .
5）影响纸片药敏结果的因素： 培养基的质量：MH琼脂、pH(7.2~7.4)、深度（4mm)等。 药敏纸片的质量（直径6.35mm、吸水量20μl)药含量 . 接种菌量正确与否（麦氏比浊标准的配制：625nm吸光度值为0.08~0.10）

12 试验操作质量 孵育条件：温度（37℃）、时间（16h-18h) 测量工具的精度 质控标准株本身的药敏特性是否合格。（金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25911、铜绿假单胞菌ATCC27853等）

13 （二）稀释法： 稀释法是定量测定抗菌药物抑制细菌生长作用的体外方法，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。 稀释法所测的某抗菌药物能抑制检测菌肉眼可见生长最低浓度称为最低（或最小）抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）

14 1）试管稀释法（rube broth method）
肉汤稀释法 1）试管稀释法（rube broth method） 2）微量稀释法（microdilution broth method） 采用微量稀释孔（0.1ml肉汤）

15 结果判定 以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC（μg/ml）。微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否细菌生长。

16 临床意义 临床上较为广泛使用的定量耐药性检测方法。尤其是微量稀释法，已有商品化的微量稀释板。

17 3.E试验 1）原理 E试验（Epsilometer test） 是一种结合稀释法和扩散法原理测定微生物对药物敏感试验的定量技术。

18 细菌生长区 E试条 抑制浓度（IC） E试条是一条5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。抗生素的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围 。 结果判断：将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC） 椭圆形抑菌圈

19 杀菌试验 1.最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）测定
常用于消毒剂杀菌效果的判定，新药的评价。

20 2.时间——杀菌曲线法 用于评价一种抗菌药物对测试菌的杀菌速率。

21 联合药敏试验 当下列情况发生时，需作体外联合药敏： 1.治疗混合性感染； 2.预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；
3.联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量； 4.联合用药比单一用药时效果更好。

22 联合用药后的结果： 1、协同作用（synergy） 2、相加作用（addition） 3、无关作用（indifference） 4、拮抗作用（antagonism）

23

24

25

26 方法：试管棋盘稀释法 微量棋盘稀释法 纸片法

27 细菌耐药机制 β～内酰胺酶 抗菌药物作用靶位的改变 产生水解酶、修饰酶 氨基糖甘类顿化酶 细菌膜通透性降低 细菌外膜上主动外排泵的作用
生物膜的形成

28 细菌耐药性检测 1.β～内酰胺酶检测 2.耐药基因检测 3.特殊耐药菌的检测 耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）检测 耐青霉素肺炎链球菌检测

29 1. β～内酰胺酶检测 1）碘淀粉法 原理 ： β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺酶环形成青霉素噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的蓝色复合物，使蓝色变为无色。 结果判定： 当含青霉素培养基内的待测菌加入可溶性淀粉和碘液后，10分钟内能使蓝色完全消退的待测检为产β-内酰胺酶阳性株。 临床意义：阳性者为产β-内酰胺酶，对青霉素类抗生素耐药。

30 2）产色头孢菌素法 原理： 产色头孢菌素如头孢哨噻吩的β-内酰胺酶环能被β-内酰胺酶破坏，使其颜色由浅黄变为粉红色。 结果判定：
将待测菌涂于产色头孢菌素纸上法，30分钟内变红色者表示该菌株产生β-内酰胺酶。 临床意义： 阳性者为产β-内酰胺酶，对青霉素类抗生素耐药 。

31 2.耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）检测 1）定义 1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10mm，或其MIC≥4μg/ml的金黄色葡萄球菌、对1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17mm，或MIC≥0.5μg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌称耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin reaphylococcus, MRS） 2）临床意义 MRS不论其体外药敏试检结果，所有的β-内酰胺类药物和β-内酰胺抑制剂均无临床疗效；绝大多数的MRS常示多重耐药，包括氨基糖苷类、大环内脂类、四环素类。

32 3.耐青霉素肺炎链球菌检测 1)定义 当对1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径＜20mm或MIC＞0.06应视为耐青霉素肺炎链球菌（vancomycin resistant enteroccoccus, VRE） 2)临床意义 PRSP对氨苄西林、氨苄西林、舒巴坦、头孢克肟、头孢唑肟，临床治疗的疗效很低。但应检测对头孢曲松、头孢噻肟和美咯培南的MIC以判断是否对这些抗生素敏感。

33 4.耐药基因检测 细菌耐药性的产生和染色体上基因的突变及外来耐药遗传物质（如耐药质粒）的转移重组有关，检测某些耐药基因可监测其耐药性，如mecA、VanA、VanB等基因。 耐药基因的检测方法有PCR、生物芯片、自动DNA测序等技术。