蚯蚓腔腸富集共生染料脫色菌株生產生物可分解高分子材料之可行性研究

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1 蚯蚓腔腸富集共生染料脫色菌株生產生物可分解高分子材料之可行性研究
四環四A 邱繼緯 4960N056

2 摘要 由於經蚯蚓腔腸消化之土壤具有菌相富集放大且不具 生物毒性之特性，因此本研究自本土蚯蚓腔腸內篩選 出可具染料脫色功能性微生物來作綠色生物材料生產 之永續應用以瞭解染整廢水處理並同時生產生物可分 解性高分子(聚羥基烷酯類(poly-hydroxyalkanoate), PHA)之可行性。首先取定本土紅蚯蚓(Eisenia fetida) 經排土後，以平板塗抹出具脫色活性之菌落，再以外 加其他營養源之PBS 培養基培養條件下，在14 種不同 染料環境下進行初步篩選後

3 並分別選擇脫色能力較佳之2 種染料以月桂酸作為碳 源條件，在相同碳源濃度(5 g/L)進行批次培養，作可 行刺激碳源探討進行菌體生長與PHA生產之影響效應 以決定出最佳組合。並與先前自行自東北及西南台灣 篩選之嗜水性產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila NIU01 及YTl1 (Chen et al., 2008;2009)以相同濃度(5 g/L)月桂酸作為最佳碳源培養之PHA產量作為評比， 以分析開發應用於染整廢水處理並同時回收生物可分 解性材料之可行性。

4 篩選蚯蚓腔腸混菌之脫色能力 1.菌落篩選：取台灣本土紅蚯蚓，依Filter Paper Method(Dalby et al., 1996)之實驗方法進行排土，將排 土後之液體以8200 unit/L紐黴素濾除黴菌滋生 2.培養基質 3.使用染料：非偶氮染料、單偶氮染料、雙偶氮染料、

5 4.實驗方法：將滅菌過後之試管裝入5 mL之培養基質， 加入1％之菌液，並且同時做染料與菌液之空白樣品， 以傾斜方式裝入試管架中，增加液面與空氣之接觸面 積，以30℃、125 rpm 條件下搖瓶培養12 小時，隨即添 加各染料濃度為50 mg/L後，開始靜置並定時同時進 行染料及菌濃度之量測。

6 聚羥基酯類之生產能力比較 1.菌落選擇：依混菌菌落對各染料之脫色能力比較， 以每種混菌菌落最佳脫色之兩種染料
2.培養基質：所有目標混菌-染料組合以外加其他營養 源之PBS 培養液進行前培養20-24小時後，保存於40% (v/v)甘油並作凍管庫存。

7 3.實驗方法：首先將所有目標混菌-染料組合以外加其 他營養源之PBS 培養基進行前培養20-24 小時後，再 殖菌5 mL進入裝盛100 mL MR 培養液之500 mL三角搖 瓶，並添加1 mL TES-I與0.1 mL TES-II，30℃，200 rpm，72 小時。發酵結束後，將發酵液置於4℃使月桂 酸完全變成固體，再以濾紙(ADVANTEC，NO.5A，7 μm)過濾分離月桂酸與菌體，菌體再以蒸餾水清洗三 次(6000 rpm，10 分鐘)，菌體以100℃烘乾8 小時以上， 再放置坩堝中至完全乾燥，以待分析PHA產率。

8 4. PHA濃度分析：PHA濃度分析利用氣相層析儀(gas chromatography，SRI 8610C，USA)進行分析。

9 結果與討論

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14 結論 本研究所使用之培養基質(甘油-PBS+MM)與先前研究 (Chen et al., 2008;2009; 2010)使用富營養的培養基(LB) 相比較下，各混菌可能比較無法有效利用能量基質來 進行脫色。且混菌中可能仍存在非脫色菌佔優勢之菌 種，導致脫色效率較低，期望待後續馴養以增加其脫 色能力，以分離純化出新型脫色菌株後，並與先前研 究 (Chen et al., 2008; 2009; 2010)使用相同之培養基 (LB)作脫色能力之比較。

15 在聚羥基酯類之生產能力部份，由於混菌中可能亦以 非生產PHA之菌種占優勢，但已可從各混菌-染料組合 當中找出可能有可生產PHA之優勢菌株之組合(2- RR198、2- RB5、3- RBu198、4- RR198)，後續將以 Nile red染色法 (Spiekermannet al., 1999)作為分離純 化之基礎，於 UV 紫外燈燈炬箱下觀察其菌落螢光反 應狀態，若具橘紅螢光反應，則表示細菌體內含脂質 (lipid)堆積物，藉此篩選出具有累積PHA的菌株。並 對照以染料馴養及分離純化後之脫色菌株，尋找在染 料廢水處理之同時又可回收出附加剩餘價值資源再利 用之生物可分解材料之菌株。

16 參考文獻 1. B. Y. Chen, W. M. Chen, F. L. Wu, P. K. Chen and C. Y. Yen, “Revealing azo-dyedecolorization of indigenous Aeromonas hydrophila from fountain spring inNortheast Taiwan,” J. Chin. Inst. of Chem. Engrs., 39, (2008). 2. B. Y. Chen, K. W. Lin, Y. M. Wang and C. Y. Yen, “Revealing Interactive Toxicityof Aromatic Amines to Azo- dye Decolorizer Aeromonas hydrophila.” Journal ofHazardous Materials, 166, (2009). 3. P. A. Pekakis, N. P. Xekoukoulotakis, D.Mantzavinos., “Treatment of textiledyehouse wastewater by TiO2 photocatalysis,” Water Res., 40, 1276–1286 (2006) 4. Youn-Joo An, “Assessing soil ecotoxicity of methyl tert- butyl ether using earthworm bioassay; closed soil microcosm,” Environmental Pollution, 134, (2005).