第2节 大肠杆菌表达系统.

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1 第2节 大肠杆菌表达系统

2 http://www.expasy.ch 1 了解要目的基因蛋白质的一级结构
1 了解要目的基因蛋白质的一级结构 IL 11 MNCVCRLVLVVLSLWPDTAVAPGPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRL 1) 分子量、等电点 2) 信号肽 3) 糖基化 4) 蛋白酶裂解位点 5) 有无二硫键（根据C的数量初步判断）

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4 分子量、等电点

5 信号肽

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7 糖基化

8 蛋白酶裂解位点

9 2 分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点
2 分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点 atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg

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12 3 选择合适的表达系统 查看表达载体图谱及特性 插入位点是否合适 融合标签是否合适

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15 目的基因 (IL 11)引物设计 ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲xxxxxx atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg xxxxxx ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲

16 PCR扩增基因 准备模板 RNA cDNA PCR 设计表达引物 EcoRI XhoI PCR 纯化 酶切 纯化

17 PCR技术克隆基因

18 PCR反应组分 50μl volume Distilled Water X μl 10X buffer 5 μl
2.5 mM dNTP μl 25 Mm MgCl μl Template μl Forward Primer μl Reverse Primer μl Taq 酶 μl 加热盖 94 ° C 2’ 94 ° C 30’’ 55 ° C 45’’ 72 ° C 1’ 72 ° C 10’ 35 热起动 DMSO

19 酶切反应 1μl 10 x buffer（H，M，L） 1 μl 限制性内切酶 4 μl DNA (PCR产物, 质粒) 4 μl 灭菌水
Mix 37℃， 1-2 h 双酶切 EcR I, Xho I

20 琼脂糖电泳检测质粒是否切开

21 纯化酶切后的PCR产物、质粒 酚氯仿抽提, 或用kit纯化
酚/氯仿抽提法纯化DNA的步骤如下： 1、 向酶切样品中加入灭菌水至总体积为100 µL； 2、 加入等体积的酚/氯仿，涡漩； 3、 10,000 rpm，5min； 4、 转移上清至新的离心管中（应避免吸取中间层的蛋白）； 5、 加入上清体积1/10的3M乙酸钠（pH5.2）和两倍总体积的100％的乙醇，冰浴30 min。 6、 4℃离心，10,000 rpm，10 min； 7、 去上清，加100 µL 70％乙醇，洗涤沉淀； 8、 10,000 rpm 离心2 min，去乙醇； 9、 再离心1 min，去乙醇； 10、真空干燥，完全去除乙醇以后，重溶于10 µL灭菌水中， –20℃保存，备用。

22 连接反应 10 μl X μl 载体 X μl DNA X μl ddWater 1μl X T4 连接酶buffer 1μl PEG 1μl T4 DNA连接酶

23 质粒提取、酶切 目的基因克隆 酶切 连接、转化克隆质粒 PCR筛选，酶切确认，提取质粒测序

24 转化宿主细胞 37 ℃ ，倒置平板过夜 1 l重组载体+10 l水 50 l感受态细胞（冰浴中） 冰水中30 min
42℃水浴75 sec 加入1 ml LB液体培养基 混匀, 37℃水浴，1 h 6,000 rpm，2 min 去掉大部分上清液 留100 l左右,悬起细胞 涂平板 LB平板 抗生素 半开盖， 37 ℃ 15min 37 ℃ ，倒置平板过夜

25 挑选菌落, 保种, PCR检测, 或测序

26 提取质粒原理及方法 1.大肠杆菌染色体DNA分子量很大。在提取质粒过程中，染色体DNA往往断裂成线状大分子；质粒的分子量较小，是共价闭合环状的超螺旋DNA。 2.当细胞用碱裂解时(pH l2.0—12.6)，线状DNA发生变性，共价闭环的质粒DNA不发生变性。 3.在高盐浓度下将裂解液pH恢复至中性时，变性了的染色体DNA交织成网状而发生沉淀，可以用离心的方法除去染色体DNA沉淀物。共价闭环的质粒DNA不发生沉淀,留在离心上清液中。 4.用有机溶剂沉淀出质粒DNA。

27 1. 培养细胞, 加抗生素 2. 收集细胞 , 14,000 × g , 1 min. 3. 悬浮细胞 于 0.3 ml of Solution I [15 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A]. 碱变性 Add 0.3 ml of Solution II (0.2 N NaOH, 1% SDS) , gently mix, Incubate at room temperature for 5 min. Note: The appearance of the suspension should change from very turbid to almost translucent.

28 4. 高盐、复中，Slowly add 0. 3 ml of 3 M potassium acetate (pH 5
4. 高盐、复中，Slowly add 0.3 ml of 3 M potassium acetate (pH 5.5), mixing gently during addition. A thick white precipitate of protein and E. coli genomic DNA will form. Place the sample on ice for 5 to 10 min. 5. 离心 Centrifuge for 10 min at 14,000 × g.

29 6. 沉淀 Gently transfer the supernatant to the tube containing isopropanol. Avoid any white precipitate material. Mix by gently inverting tube a few times and place on ice for 5 to 10 min. 7. 收集DNA， Centrifuge the sample for 15 min at 14,000 × g at room temperature.

30 8. 洗涤, 70% ethanol to each tube
8. 洗涤, 70% ethanol to each tube. Invert the tube several times to wash the pellet. Centrifuge for 5 min at 14,000 × g at room temperature. 9. 去上清液 10. 风干 5 to 10 min at room temperature and dissolve the DNA in 40 μl TE.

31 试表达 SDS-PAGE检测表达情况

32 RNA HHR3 纯化 转化宿主菌 BL21 BL21(DE3) JM109 EcoR I Xho I cDNA Bal I PCR
pBR322 ori pGEX 4T1 4900bp EcoR I Xho I Bal I cDNA PCR EcoRI/XhoI 双酶切 EcoRI XhoI HHR3 纯化 pGEX 4T1 4900bp T4DNA连接酶 转化宿主菌 BL21 BL21(DE3) JM109

33 工作进程 第一天, PCR扩增基因 摇质粒菌 第二天, 提质粒 纯化PCR产物和质粒 酶切,纯化 连接 第三天, 转化
第四天, 挑菌株检测, 保种 过夜培养 第五天, 转培养,诱导表达 第六天, SDS-PAGE 检测

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35 融合表达 融合表达特别注意： 各种类型原核表达系统的构成和特点 *表达读框与载体上的标签要一致，不能移码！！！
外源基因与载体上的一段蛋白质编码基因形成一个读框, 表达出融合蛋白 融合表达特别注意： *表达读框与载体上的标签要一致，不能移码！！！ *如果表达后要切去标签，需要在构建载体前检查目 的蛋白中有无相同的蛋白酶裂解位点。

36 pGEX pGEX 2T 复制子 筛选标记 可控启动子 终止子 多克隆位点
谷胱甘肽巯基转移酶基因(GST),外源基因与GST融合表达成为一个杂和蛋白。 可以用蛋白酶切下来。 pGEX

37 pET 表达载体 His Tag

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39 非融合表达 独立的外源基因表达,更接近天然的蛋白质

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42 2）常形成包涵体，复性效果差 大肠杆菌表达系统的问题 缺点 1）缺乏翻译后修饰，如糖基化 3）蛋白质易被降解 4） 内毒素难以除尽 优点
1）简单,经济,快速 2）适合于制备抗体,供下游研究