第二章 蛋白质化学 第一节 蛋白质概述 第二节 蛋白质的组成单位-氨基酸 第三节 肽 第四节 蛋白质的结构 第五节 蛋白质结构与功能关系

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2 第二章 蛋白质化学 第一节 蛋白质概述 第二节 蛋白质的组成单位-氨基酸 第三节 肽 第四节 蛋白质的结构 第五节 蛋白质结构与功能关系
第一节 蛋白质概述 第二节 蛋白质的组成单位-氨基酸 第三节 肽 第四节 蛋白质的结构 第五节 蛋白质结构与功能关系 （重点、难点） 第六节 蛋白质的性质与分离、分析技术 第七节 蛋白质组学简介

3 第一节 蛋白质概述 一、蛋白质的定义 是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的生物大分子 。

4 二、蛋白质的重要生物学意义 1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分 2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者 蛋白质占干重 人体中（中年人）
蛋白质占干重 人体中（中年人） 人体 45% 水55% 细菌 50%~80% 蛋白质19% 真菌 14%~52% 脂肪19% 酵母菌 14%~50% 糖类＜1% 白地菌 50% 无机盐7% 2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者 （1）酶的催化作用 （2）调节作用(多肽类激素) （3）运输与储藏功能 （4）运动功能 （5）免疫保护作用(干扰素) （6）接受、传递信息的受体

5 三、蛋白质的组成 1.元素组成 2.蛋白质的组成单位----氨基酸 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。 这20种氨基酸被称为基本氨基酸。
碳 50％ 氢 7％ 氧 23％ 氮 16% 硫 0—3％ 其他 微量的磷、铁、碘、锌和铜等 蛋白质含量=（总氮含量－无机氮含量）×6.25 2.蛋白质的组成单位----氨基酸 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。 这20种氨基酸被称为基本氨基酸。

6 四、 蛋白质的分类 1. 依据蛋白质的外形分类： 球状蛋白质：外形接近球形，溶解性较好，大多数 纤维状蛋白质：类似纤维或细棒。
蛋白质属于这一类。 纤维状蛋白质：类似纤维或细棒。 分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。(前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等；后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等)

7 2、依据蛋白质的组成分类 简单蛋白(simple protein) （或单纯蛋白） 结合蛋白(conjugated protein) （或缀合蛋白）

8 简单蛋白 又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由氨基酸组成的肽链，不含其它成分。 1、清蛋白和球蛋白： 2、谷蛋白和醇溶谷蛋白： 植物蛋白
3、精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在于细胞核中。 4、硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织 中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。

9 结合蛋白 由简单蛋白与其它非蛋白成分(辅基、配基)结合而成。 色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、 叶绿蛋白和细胞色素等。
糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋 白等。 脂蛋白：由简单蛋白与脂质结合而成。 如血清-，-脂 蛋白等。 核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖 核蛋白等。 磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、 角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等

10 3、依据蛋白质的功能分类 P19 活性蛋白 4、依据蛋白质的结构分类 非活性蛋白 (1)单体蛋白:一条肽链
(2)寡聚蛋白:两个及以上三级结构的亚基 (3)多聚蛋白:数十个亚基以上

11 第二节 蛋白质的组成单位---氨基酸 蛋白质的水解 水 解 酸水解: 碱水解: 酶水解: 部分水解

12 20种基本氨基酸

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14 一、氨基酸的结构通式 不带电形式 两性离子形式

15 不变部分 可变部分 各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同。 20种AA除脯氨酸外均为- AA 除甘氨酸外, α-碳原子都为不对称碳原子 旋光性：＋、－（除甘氨酸没有旋光性） 构型：D－、L－（除甘氨酸，天然蛋白质的AA均为L－AA）

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17 二、氨基酸的分类 （一）常见的蛋白质氨基酸 （二）蛋白质中不常见的氨基酸 修饰性氨基酸: 羟脯氨酸 （三）非蛋白质氨基酸：
修饰性氨基酸: 羟脯氨酸 （三）非蛋白质氨基酸： 不参与蛋白质组成，如瓜氨酸、鸟氨酸

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19 非极性AA

20 不带电荷极性AA

21 带电荷极性AA

22 P22

23 三.氨基酸的重要理化性质 1.一般物理性质 a. 溶解性：溶于水 b. 熔点：高 c. 味感： d. 旋光性：甘氨酸除外 e. 光吸收：

24 氨基酸在可见光区没有光吸收，在近紫外区（200-400nm）只有芳香族氨基酸有。
酪氨酸的max＝275nm， 苯丙氨酸的max＝257nm， 色氨酸的max＝280nm，; 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。

25 2.氨基酸的离解性质 两性离子指在同一个分子中含有等量的正负两种电荷。同一个氨基酸分子带有能放出质子的(-NH3+)正离子和能接受质子的羧基 (-COO-)负离子。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化 净电荷 正离子 状态 两性离子 负离子状态 等电点pI

26 氨基酸的等电点 调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的-NH3+基和-COO-基的解离程度完全相等时，即氨基酸所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。 在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。 注意： 1） 由于静电作用，等电点时氨基酸的溶解度最小，易沉淀。 2） 氨基酸的pI是特征性常数，只与结构有关。 3） pI的确定： 酸碱滴定法测定 氨基酸的可解离基团的pK计算

27 氨基酸的可解离基团的pK计算 pH = - lg[H+] pK = -lgK
侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于 两性离子两边的pK’值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH3+ )/2

28 3.氨基酸的主要化学反应 (1)与茚三酮的反应（颜色反应）

29 (2) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应 反应特点 A.为α- NH2的反应 B.氨基酸α- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)
C.在弱碱性条件下，与 DNFB 发生芳环取代，生成黄色二硝基苯氨基酸 应用：a.测定参与Sanger反应的氨基酸种类 b.鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸

30 (3)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应

31 Edman （异硫氰酸苯酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。

32 一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间脱水缩合形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。
第三节 肽 （一)肽 一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间脱水缩合形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。 三肽、寡肽(几个-十几)、 多肽（蛋白质） 组成多肽的氨基酸单元 称为氨基酸残基。

33 (二)肽链中AA的排列顺序和命名 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。 主链骨架
N-端(用H表示)、C-端(用OH表示) 多肽命名：自N端 C端，按AA顺序,以AA名字命之。 多肽习惯书写：左（N端） 右（C端） 如上述五肽可表示 为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln（S-V-Y-D-Q）

34 （三） 肽单位平面与二面角 肽平面（peptide plane）：肽链主链的肽键C-N具有双键的性质， 因而不能自由的旋转，使连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上，此平面称为肽单位平面，又称酰胺平面。通常是反式的。

35 二面角：肽平面的连接处为α碳原子。它与相邻的两个参与肽键形成的C和N原子之间的单键可以在一定范围内转动，Cα-N 之间称φ角，在Cα-C 之间称ψ角，这就是α-碳原子上的一对二面角。这对二面角决定了相邻肽平面的相对位置。 相邻两个肽平面上的二面角

36 (四)肽的理化性质 小肽的理化性质与氨基酸类似,如晶体的熔点高,在水溶液中两性离子。 肽的化学反应与氨基酸同,但有些特殊反应 如双缩脲反应。

37 天然存在的重要多肽 在生物体中多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。
（被酶解后才表现其生理活性） 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

38 谷胱甘肽（GSH） 2GSH GSSG 还原型 氧化型 SH COOH CH2 H2N-CHCH2CH2CO— NHCHCO —
Cys H2N-CHCH2CH2CO— COOH γ-Glu NHCH2COOH Gly 2GSH GSSG 还原型 氧化型 作用：1、 保护含有巯基的蛋白质;保护机体免遭损害。 2、作为辅酶在体内氧化还原反应中起重要作用。

39 第四节 蛋白质的结构

40 (一) 蛋白质的一级结构 一级结构（primary structure）：即蛋白质的化学结构，是指多肽链上各种氨基酸残基的种类和排列顺序，也包括二硫键的数目。 牛胰岛素的一级结构： 51个氨基酸，A（21肽）、B（30肽）两条肽链，A链内一对S-S，A和B链间2对S-S

41 一级结构中包含的共价键（covalent bonds）主要：
一级结构的连接方式： 一级结构中包含的共价键（covalent bonds）主要： 1、肽键（peptide bond） 2、二硫键（disulfide bond）

42 (二)蛋白质的空间结构 一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构
指一条或数条多肽链上所有原子和基团在三维空间上的排布，即构象（conformation）或空间结构。 　　一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构

43 1.蛋白质的构象 1）研究蛋白质构象的方法： X射线衍射，核磁共振等。 2） 构型与构象 蛋白质的构象：在蛋白质分子中由于单键的旋转所产生的所有原子或基团的空间排列。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。 构型：指在立体异构体分子中取代原子或基团的空间排布。

44 2.维持蛋白质构象的作用力： 蛋白质分子中的化学键 a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键

45 氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为 次级键; 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大; 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要;
盐键（离子键） 氢 键 范德华力 氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为 次级键; 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大; 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要; 盐键数量小; 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多， 蛋白质分子构象越稳定。 疏水相互作用力

46 3.蛋白质的二级结构 蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的、重复的几何走向、旋转及折叠。
1）主要有: -螺旋、-折叠、 -转角、 -凸起、自由回转

47 -螺旋：肽平面围绕同一轴旋转

48 -螺旋 （-helix） 在-螺旋中肽平面的键长和键角一定，其要点如下： ① 多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基 ②螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧，相邻的螺圈间形成链内氢键，氢键的取向几乎与轴平行。 ③ 绝大多数蛋白质分子为右手-螺旋。 左手和右手螺旋

49 胶原蛋白的结构

50 -折叠 （-pleated sheet)
-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。 -折叠有两种类型：一种为平行式，另一种为反平行式

51 -角蛋白 丝心蛋白(fibroin)这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。
丝心蛋白是典型的反平行公式折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象.

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53 -转角 -turn 为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。 N—4CH—C C 3CH N—H O=C 2CH N C—1CH—N R H O β-转角经常出现在连接反平行β-折叠片的端头。

54 β-转角 ① 180°的转角部位 转角,含4个AA,3个肽键平面? ②由4个氨基酸残基构成
③由第一个残基的羰基氧（O）与第四个残基的氨基氢（H）可形成氢键 ④多含脯氨酸和甘氨酸 转角,含4个AA,3个肽键平面?

55 -凸起 无规卷曲（自由回转） 酶的功能部位常处于这种结构中。
　　没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象．不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同． 酶的功能部位常处于这种结构中。

56 核糖核酸酶（Nase）的某些二级结构

57 4. 超二级结构 ★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。 几种类型的超二级结构：α α；ββ；βαβ；βββ。
　　几种类型的超二级结构：α α；ββ；βαβ；βββ。 　　★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。 α α ββ βαβ

58 蛋白质的空间结构 二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构

59 5、结构域（domain） 结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。
对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上． 在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性． ★结构域与功能域的关系： 有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是； 功能域包含一个但通常是多个结构域。

60 6、三级结构 蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成一个紧密的近似球形的特征三维结构。 可以是一条或多条肽链组成，但多条肽链间由二硫键相连。

61 肌红蛋白：只有一条多肽链组成，称为单体蛋白质。
形成八段α－螺旋体。 整个肌红蛋白分子呈紧密的球形。

62 7、蛋白质的四级结构 蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的聚合体结构形式； 这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位（Subunit）； 亚基与肽链

63 血红蛋白四级结构的测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点：
球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基 两条α链，两条β链，α2β2 α 链：141个残基； β链：146个残基 分子量 含四个血红素辅基 亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部

64 蛋白质分子 结构层次 一级结构（多肽链上的氨基酸排列顺序） 二级结构（多肽链主链骨架的局部空间结构） 超二级结构（二级结构单位的集合体）
结构域（多肽链上可以明显区分的球状区域） 三级结构（多肽链上所有原子和基团的空间排布） 四级结构（由球状亚基或分子缔合而成的集合体）

65 第五节 蛋白质分子结构与功能的关系

66 一、蛋白质一级结构与功能的关系 （二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能； P47 （三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息，如：
（一）一级结构是空间构象的基础； （二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能； P47 （三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息，如： 一级结构种属差异与分子进化 : 同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质. 同源蛋白一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来 说都是相同的，称为不变残基； 其他位置的氨基酸称可变残基。

67 不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.
例：细胞色素C 近60多个物种中，有 35个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基. 可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素 C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）. 黄色：不变残基 未标记：可变残基

68 根据的Cytc的氨基酸种属差异建立的系统发生树

69 （四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病：
---分子病 例 镰刀形贫血病 患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S） （Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基 使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，不易通过毛细管，导致组织缺血 这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性 -链N端氨基酸排列顺序 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys… Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…

70 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子。 例：胰岛素
体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原。 蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子。 例：胰岛素

71 二、 蛋白质的高级结构与功能的关系 例：血红蛋白的别构效应 2、蛋白质的变性
1、别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象. 例：血红蛋白的别构效应 2、蛋白质的变性

72 血红蛋白输氧功能和构象变化 Hb O2 Hb- O2 血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线 Myoglobin Hemoglobin
活动肌肉毛细血管中的PO2 肺泡中的PO2 Myoglobin Hemoglobin O2 Hb Hb- O2

73 蛋白质的变性 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。

74 第六节 蛋白质的性质、分离分析技术 一、蛋白质分子量的测定方法 测定方法：渗透压法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、超离心法

75 ? 若蛋白含 Trp 0.58% ，其最低相对分子质量是多少？
根据化学组成测定最低相对分子量 如Mb含铁量为0.335%，其最低相对分子质量为： 铁的原子量 Mb最低相对分子质量＝ ×100 铁的百分含量 ＝55.8/0.335 ×100＝16 700 ? 若蛋白含 Trp 0.58% ，其最低相对分子质量是多少？ 若实际测Mr为70 350，问蛋白质含几个Trp ？(Trp Mr=204) Mr= ； 蛋白质含2个Trp

76 二、 蛋白质的两性离解及等电点 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。
在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在pH大于等电点溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在pH小于等电点溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳。 利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。

77 分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。
电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。 1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上 进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。

78 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。
1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 + — 2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。 - +

79 （3）等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。
5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 + － 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 + － + － + － 通电 + －

80 三、蛋白质的变性 某些物理或化学因素，蛋白质分子内部原有的高度规律性结构发生改变，致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有所改变，但其一级结构不被破坏，这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。

81 引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌等物理因素。
强酸、强碱、尿素、重金属盐等化学因素。

82 （二）蛋白质的复性 2.某些理化性质的改变：溶解度降低，黏度增加，扩散 系数变小等；
★ 变性后蛋白质性质的改变（表现）： 1. 生物活性丧失：酶失去催化能力 2.某些理化性质的改变：溶解度降低，黏度增加，扩散 系数变小等； 3.生化性质的改变：肽链松散，反应基团暴露，对蛋白酶降解的敏感性增大。 （二）蛋白质的复性 在一定条件下可以恢复活性.

83 8 M urea and -mercapotoethanol
核糖核酸酶变性与复性作用 Denative reduced ribonuclease Native ribonuclease 8 M urea and -mercapotoethanol 变性 Dialysis 复性 Native ribonuclease

84 四、蛋白质的胶体性质 由于蛋白质的分子量很大，分子大小达到胶体质点范围（分子直径在1-100nm之间）, 具有较大表面积。
蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动、电场中泳动、散射、不能通过半透膜、具有吸附能力等。

85 透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。

86 蛋白质在水溶液中为较稳定的亲水胶体而 不易沉淀原因： 1）水膜（水化层） 2）蛋白质颗粒在非等电点时带同性电荷 + +

87 五、蛋白质的沉淀 ①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。
②有机溶剂沉淀法  破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀 往往是不可逆的。(但某些乳品加热变性并不沉淀)

88 六.蛋白质的颜色反应 1.双缩脲反应： 两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成红紫色的复合物 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应 肽键的反应，肽键越多颜色越深 受蛋白质特异性影响小 蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度

89 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物，灵敏度比双缩脲法提高100倍
2.福林试剂反应 酪氨酸的反应（还原反应） 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合---Lowry法 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物，灵敏度比双缩脲法提高100倍 3.米伦氏反应 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应） 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色 4.乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸

90 5.坂口反应 精氨酸的反应（胍基的反应） 精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物 鉴定蛋白质中是否含有精氨酸 定量测定精氨酸 6.茚三酮反应 7.考马斯亮蓝G-250 本身为棕红色，与蛋白质反应呈蓝色 与蛋白的亲和力强，灵敏度高 微克/毫升

91 七、蛋白质含量的测定 化学方法：考马斯亮蓝染色法、凯氏定氮法、 双缩脲法、福林试剂 物理化学性质：紫外吸收法 其他 八、蛋白质的分离分析技术

92 凝胶过滤

93 交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）

94 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

95 SDS-PAGE

96 蛋白质的纯化精制：

97 亲合层析 利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(生物学亲合力)分离蛋白质的方法 能与配体结合的蛋白质被最后洗出
不能结合的蛋白质更快地被洗出

98 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 配基：
酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。 免疫亲和层析 凝集素亲和层析 金属螯和层析 染料配体层析

99 蛋白质氨基酸序列的确定 (蛋白质一级结构的测定) 测定步骤
蛋白质氨基酸序列的确定 (蛋白质一级结构的测定) 测定步骤 1）蛋白质样品预处理:确定多肽链数目；拆分 2）确定每条多肽链的氨基酸种类、数目和含量 3）分析多肽链的N-末端和C-末端。 4）多肽链断裂成多个肽段 5）肽片段的分离纯化： 6）测定每个肽段氨基酸顺序。 7）用片段重叠法确定肽段在多肽链中的次序 8)二硫键位置确定。

100 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基乙醇还原法拆分多肽链间的二硫键。
蛋白质一级结构的测定 1.二硫键的断裂 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基乙醇还原法拆分多肽链间的二硫键。

101 2、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；(HPLC)

102 末端基氨基酸测定  二硝基氟苯（DNFB）法
3、分析多肽链的N-末端和C-末端。 末端基氨基酸测定  二硝基氟苯（DNFB）法 Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。

103  丹磺酰氯法(DNS) 末端基氨基酸测定 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。
此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。

104 末端基氨基酸测定 氨肽酶法 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。

105 末端基氨基酸测定  肼解法 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。

106 末端基氨基酸测定 羧肽酶法 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。

107 可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。
蛋白质一级结构的测定 4、多肽链断裂成多个肽段： 可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

108 蛋白质水解 蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.
完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。

109  酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶  化学法：(Cyanogen bromide)
溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 最常见的蛋白水解酶有以下几种： 多肽链的选择性降解

110 胰蛋白酶 水解位点 Trypsin ：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2不为Pro.

111 R1=Phe, Trp, Tyr; R2不为Pro.pH8-9
糜蛋白酶 水解位点 肽链 胰凝乳蛋白酶 R1=Phe, Trp, Tyr; R2不为Pro.pH8-9 胃蛋白酶： R2=Phe, Trp, Tyr,Val; R1不为Pro,pH2 葡萄球菌蛋白酶：R1=Asp,Glu

112 利用凝胶过滤、电泳或高效液相层析将部分裂解的样品分离纯化，得到两套或多套肽片段。
蛋白质一级结构的测定 5、肽片段的分离纯化： 利用凝胶过滤、电泳或高效液相层析将部分裂解的样品分离纯化，得到两套或多套肽片段。

113 蛋白质一级结构的测定 6、测定每个肽段的氨基酸顺序。

114 7、用片段重叠法确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
蛋白质一级结构的测定 7、用片段重叠法确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

115 蛋白质一级结构的测定 8.确定原多肽链中二硫键的位置。

116 例：某蛋白质肽链的一个片段为十肽，用两种水解法水解， A法得四个片段小肽： A1 ： Ala·Phe; A2 ：Gly ·Lys· Asn· Tyr; A3 ：Arg· Tyr; A4 ：His· Val B法得三个片段小肽： B1 ： Ala·Phe · Gly ·Lys ; B2 ： Asn· Tyr· Arg; B3 ： Tyr · His· Val 肽 顺 序 A1 B1 A2 B2 A3 B3 A4 十肽顺序 Ala·Phe Ala·Phe · Gly ·Lys Gly ·Lys· Asn· Tyr Asn· Tyr· Arg Arg· Tyr Tyr · His· Val His· Val Ala·Phe · Gly ·Lys· Asn· Tyr ·Arg·Tyr · His· Val

117 第七节 蛋白质组学简介 一、什么是蛋白质组学？ 二、蛋白质组学的研究方向及意义 三、研究蛋白质组学的技术方法

118 一、什么是蛋白质组学？ 这个概念最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

119 二、蛋白质组学的研究方向及意义 目前，在蛋白质功能方面的研究是极其缺乏的。大部分通过基因组测序而新发现的基因编码的蛋白质的功能都是未知的，而对那些已知功能的蛋白而言，它们的功能也大多是通过同源基因功能类推等方法推测出来的。在未来的几年内，随着至少30种生物的基因组测序工作的完成，人们研究的重点必将转到蛋白质功能方面，而蛋白质组的研究正可以完成这样的目标。 蛋白质组学的研究方向： 1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。 2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。

120 蛋白质组学研究是更艰巨更复杂具有重要意义的阶段。
3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。 4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。 蛋白质组学研究是更艰巨更复杂具有重要意义的阶段。

121 三、研究蛋白质组学的技术方法 同时研究很多蛋白时，提取你的目的蛋白组，然后分离鉴定。
分离鉴定有两种途径：一是用双向电泳，二是用LC-MS/MS也就是液相和质谱联用。 分离鉴定后分析数据。

122 内容小结 蛋白质的生物学作用：功能蛋白、结构蛋白 蛋白质的分类：按外形及组成分类 蛋白质的组成（元素组成、化学组成）及蛋白质含量的测定
二十种氨基酸的结构、分类及名称（三字缩写符） 氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应、与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应 蛋白质的一级结构：肽、肽键、活性多肽 蛋白质的空间结构：二级结构单元（ -螺旋、-折叠、 -转角、自由回转）、三级与四级结构（超二级结构、结构域、亚基）及结构与功能的关系 蛋白质的性质：大分子性质、两性解离（等电点、电泳、离子交换）、胶体性质、蛋白质沉淀、蛋白质变性、紫外吸收及颜色反应。

123 参考书目 生物化学原理.杨荣武主编，北京:高等教育出版社出版，2012.
生物化学简明教程（第四版）.罗纪盛等主编，北京:高等教育出版社出版,2009. 生物化学（第三版）.王镜岩、朱圣庚等主编，北京:高等教育出版社 基础生物化学.陈惠主编，北京:中国农业出版社，2014. Nelson D L, lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. New York: W. H. Freeman,2004.