總生菌數測定：平板計數法 (plate count)- 稀釋塗抹法

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1 總生菌數測定：平板計數法 (plate count)- 稀釋塗抹法

2 目的 原理 材料與儀器 步驟與方法 實驗注意事項 實驗結果

3 目的 總生菌數是指食品在經過處理，並於一定條件下進行培養後，所得1 g或1 ml檢測樣本中所含的活細菌總數。總生菌數的測定除了可作為判別食品被汙染的程度，也可應用此一測定方法觀察細菌在食品中繁殖的情形，以便對被檢測之樣品進行衛生之評價時提供依據。本實驗是利用稀釋之方法讓學生學習並掌握總生菌計數之檢測。

4 原理 微生物的生長指的為其細胞數目的增加，而一般要測定樣品中的總菌數通常以測定容量(ml)或重量(g)單位中微生物的數量來表示，但由於細菌本身數量很龐大，故通常只取一小部分的樣本，再藉由一系列的稀釋使菌落在培養基上生長數目介於 colony forming unit (CFU)之間，此即為利用稀釋方測定總菌數之原理所在。

5 材料與儀器 材料 設備儀器及其他用具

6 材料 Bacteria 磷酸緩衝液 (Butterfield’s phosphate buffer, BPB, pH 7.2)
Escherichia coli 事先稀釋至10-3 磷酸緩衝液 (Butterfield’s phosphate buffer, BPB, pH 7.2) 胰化酪蛋白大豆洋菜培養基 Tryptic soy agar (TSA) 6 plates/group 胰化酪蛋白大豆洋菜培養液 Tryptic soy broth (TSB)

7 設備儀器及其他用具 無菌培養皿 恆溫培養箱 酒精燈 滅菌加蓋玻璃試管 血清瓶 滅菌燒杯 攪拌器

8 步驟與方法 食物樣品調製：液體樣品以磷酸緩衝液或生理食鹽水定量稀釋；固體樣品則先以無菌水或生理食鹽水稀釋再以果汁機打碎均勻，即為原液（如50 ml的液體或固體樣品置於450 mL之無菌水中，做成10倍稀釋之樣品液, 250g mL）。 細菌培養液: 直接取1mL (一般在隔夜培養後，E. coli菌量應在109 CFU/mL 以上)

9 十倍序列稀釋(decimally serial dilution)
稀釋：取1 mL 的混和液加入9 mL 的緩衝液中，震盪混合均勻後，再取1 mL 的混和液加入9 mL 的緩衝液中，因此每次稀釋倍數為10倍。 E. coli 培養液以磷酸緩衝液稀釋10－1、10－2、及10－3。 各組將10－3持續稀釋至10－9 稀釋時管口需燒火，加入樣品亦後需混合。

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14 將適當濃度的稀釋液，滴0.1mL于培養基中央。
Spread plate 將適當濃度的稀釋液，滴0.1mL于培養基中央。 實際稀釋濃度為-7、-8、與-9。 2 plates/dilution (理論上10 plates/dilution 最佳) 將玻棒置於70%的酒精中，將玻棒拿出後至於酒精燈上。 將玻棒至於培養基的角落，冷卻之。 將菌液均勻塗抹在培養基上。 靜置3-5分鐘後，放置於37℃恆溫培養箱中倒置培養24小時。 以菌落計數器計算菌落總數。 選取菌落數在25-250之間的培養皿作為菌落總數測定的參考標準）。

15 混稀法 Pour plate 加1 mL bacterial suspension into an empty plate
Prepare suitable medium in advance After autoclaving, medium was cool down and store at 45-55℃ Pour the medium into edge of the empty plate (DO NOT pour onto the bacterial suspension) Mix medium and bacterial suspension by moving the plate at number 8 figure

16 Colony counting Usually, colony size obtained from pour plate method is different. Colonies on medium (surface) are larger than colonies in medium (inside) because of aerobic condition.

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19 實驗結果 總生菌數(CFU/g)的計算 以稀釋法測定出之細菌數，可以以下公式計算出其總生菌數：

20 菌數計算 CFU (colony forming unit) 菌落生成單位 例: -8 38, 40 平均: 39
例: , 40 平均: 39 39 x 108 CFU/mL ; x 109 CFU/mL 9.59 log CFU/mL 若是固體樣品 25 g mL 均質 因此菌數為 3.9 x 109 CFU/mL, 3.9 x 1010 CFU/g, 10.59 log CFU/g

21 實驗注意事項 進行稀釋步驟時須確認樣品已搖晃均勻。 不可以使用一般蒸餾水(或無菌水)當做稀釋液。 常用稀釋液 生理食鹽水 saline
磷酸緩衝液 Butterfield’s phosphate buffer (BPB, pH 7.2) 磷酸緩衝生理食鹽水 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)

22 例1 ：液體樣品每毫升樣品中計數之培養皿菌落數(n)為232個；稀釋倍數(d)為103倍，則此樣品中總生菌數目為：232 × 1,000＝2
例1 ：液體樣品每毫升樣品中計數之培養皿菌落數(n)為232個；稀釋倍數(d)為103倍，則此樣品中總生菌數目為：232 × 1,000＝2.32 × 105 CFU/mL ; 5.37 log CFU/mL 例2 ：固體樣品每毫升樣品中計數之培養皿菌落數(n)為232個；稀釋倍數(d)為103倍，則此樣品中總生菌數目為：232 × 1,000＝2.32 × 105 CFU/mL 2.32 × 105 x 10= 2.32 × 106 CFU/g 6.37 log CFU/g