第四章 芳酸类药物的分析 The Analysis of Aromatic Carboxylic Acids

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1 第四章 芳酸类药物的分析 The Analysis of Aromatic Carboxylic Acids

2 第一节 典型药物分类与理化性质 包括：芳酸、芳酸酯、芳酸盐 共同点：苯环、羧基 不同点：不同的取代基（如酚羟基、芳伯氨基等）

3 一、典型药物 羧基直接与苯环相连接的药物。 根据结构分为: ▲水杨酸类 ▲苯甲酸类 ▲其它芳酸

4 1、水杨酸类 代表药物有 阿斯匹林(pKa3.49) 水杨酸(pKa2.98)
Aspirin 水杨酸(pKa2.98) salicylic acid 对氨基水杨酸（钠） sodium para-aminosalicylate

5 主要理化性质 水杨酸类药物如水杨酸、阿司匹林、对氨基水杨酸钠、双水杨酯和贝诺酯等均为固体，具有一定的熔点。分子结构中具有苯环和特征官能团，均具有紫外和红外特征吸收光谱。除对氨基水杨酸钠外，其他药物在水中微溶或几乎不溶，而能溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂中。

6 取代基为卤素、硝基、羟基时能降低苯环电子云密度，使羧基中羟基氧原子的电子云密度降低，从而增加氧氢键极性，较易离解出质子，故酸性较苯甲酸强；反之，取代基为甲基、氨基时能增加苯环电子云密度从而降低氧氢键极性，使酸性较苯甲酸弱。 基于以上的化学性质，水杨酸，阿司匹林和双水杨酯及片剂均可在中性乙醇中，以酚酞为指示剂，用标准氢氧化钠滴定液测定含量。

7 由于芳酸及其酯类药物易水解和分解，在生产和贮藏过程中容易引入水解产物。对氨基水杨酸钠和贝诺酯中应分别检查间氨基酚和对氨基酚。检查制剂中存在的特殊杂质时，因加辅料和稳定剂等，常采用色谱法，如阿司匹林胶囊和栓剂中游离水杨酸的测定即采用柱分配色谱法，适当改变柱色谱条件，也可测定药物的含量。

8 2、苯甲酸类 代表药物 氨甲苯酸 泛影酸 苯甲酸 benzoic acid (pKa 4.20)

9 主要理化性质 苯甲酸类药物均为固体，具有一定的熔点。除苯甲酸钠溶于水以外，其他药物在水中微溶或几乎不溶，苯甲酸、羟苯乙酯易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂；丙磺舒、甲芬那酸在乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂中略溶、微溶或难溶，但均溶于氢氧化钠溶液。 利用苯甲酸溶于有机溶剂、不溶于水，而苯甲酸钠溶于水不溶于有机溶剂的性质，可用双相滴定法，以盐酸为滴定剂测定苯甲酸钠的含量。

10 3、其它芳酸 代表药物 止血敏　 　布洛酚

11 主要理化性质 氯贝丁酯为无色或黄色的澄清油状液体，有特臭，味初辛辣后变甜；在乙醇、丙酮、氯仿、乙醚等有机溶剂中易溶，在水中几乎不溶。布洛芬为固体，具有一定熔点。在乙醇、乙醚、丙酮、氯仿中易溶，在水中几乎不溶；在氢氧化钠或碳酸钠试液中易溶。溶于中性乙醇后，可用氢氧化钠滴定液直接滴定测定含量。氯贝丁酯和布洛芬均具苯环和特征官能团，具有紫外和红外特征吸收光谱，可用于鉴别。也可用紫外法测定含量，如离子交换后紫外法测定氯贝丁酯的含量。

12 其他芳酸类药物 氯贝丁酯

13 二、性质 1、性状： 大多数是结晶性固体 少数为液体（水杨酸甲酯、苯甲酸苄酯） 2、溶解性： 游离芳酸类药物，几乎不溶于水，易溶于有机溶剂
芳酸碱金属盐易溶于水

14 3. 芳酸酯可水解，利用其水解得到酸和醇的性质可进行鉴别；利用芳酸酯水解定量消耗氢氧化钠的性质，芳酸酯类药物可用水解后剩余滴定法测定含量；芳酸酯类药物还应检查因水解而引入的特殊杂质。

15 4、酸性： 芳酸具游离羧基，呈酸性，其pKa在3～6之间，属中等强度的酸或弱酸，具有酸性，可以与碱成盐。 —X、—NO2、—OH等吸电子取代基存在使酸性增强 —CH3、—NH2等斥电子取代基存在使酸性减弱 邻位取代>间位、对位取代，尤其是邻位取代了酚羟基，由于形成分子内氢健，酸性大为增强 5、紫外吸收： 具有苯环，所以具有紫外吸收。

16 6. IR 7. 取代芳酸类药物可利用其取代基的性质进行鉴别和含量测定。如具有酚羟基的药物可用FeCl3反应鉴别；具芳伯氨基的药物可用重氮化—偶合反应鉴别、亚硝酸钠滴定法测定含量。 8. 色谱法—制剂分析

17 第二节 鉴别反应

18 一、与铁盐的反应 1．水杨酸极其盐在中性或弱酸性条件下，与三氯化铁试液反应，生成紫堇色配位化合物。
2．苯甲酸的碱性水溶液或苯甲酸的中性溶液，与三氯化铁试液生成碱式苯甲酸盐的赭色沉淀。 3．丙磺舒加少量氢氧化钠试液使生成钠盐后，在PH5.0～6.0水溶液与三氯化铁试液反应，机生成米黄色沉淀。 4．布洛芬的无水乙醇溶液，加入高氯酸羟胺-无水乙醇试液及N，N’-双环己基羧二亚胺（DDC）-无水乙醇试液，混合后，在温水中加热20min。冷却后，加高氯酸铁-无水乙醇液，即呈紫色。

19 二、重氮化-偶合反应 1．贝诺酯具潜在的芳伯氨基，加酸水解后产生芳伯氨基结构，在酸性溶液中，与亚硝酸钠试液进行重氮化反应，生成的重氮盐与碱性ß-萘酚偶合生成橙色沉淀。 2．甲芬那酸的甲醇溶液，与对-硝基苯重氮试液在氢氧化钠碱性条件下偶合产生橙红色。

20 三、 氧化反应 甲芬那酸加硫酸溶解后，与重铬酸钾试液反应，即呈深蓝色，随即变为蓝绿色。
三、 氧化反应 甲芬那酸加硫酸溶解后，与重铬酸钾试液反应，即呈深蓝色，随即变为蓝绿色。 甲芬那酸溶于硫酸后，加热，则溶液呈黄色，并产生绿色荧光。

21 四、 水解反应 1．阿司匹林与碳酸钠试液加热水解，得水杨酸钠，加过量稀硫酸酸化后，则生成白色水杨酸沉淀，并发生醋酸的臭气。
四、 水解反应 1．阿司匹林与碳酸钠试液加热水解，得水杨酸钠，加过量稀硫酸酸化后，则生成白色水杨酸沉淀，并发生醋酸的臭气。 2．双水杨酯与氢氧化钠试液煮沸后，加稀盐酸，即生成白色水杨酸沉淀； 3．氯贝丁酯分子中具有酯结构，碱水解后与盐酸羟胺生成异羟肟酸盐，在弱酸性条件下加三氯化铁即呈紫色异羟肟酸铁。 4. 羟苯乙酯的乙醇溶液，煮沸后加硝酸汞试液，放置后逐渐生成沉淀，上清液呈红色。

22 五、 分解产物的反应 1. 苯甲酸盐可分解成苯甲酸升华物，分解产物可用于鉴别。
2. 含硫的药物，可分解后鉴别。如丙磺舒与氢氧化钠熔融，而显硫酸盐反应。 3. 丙磺舒高温加热时，能产生二氧化硫气体，具二氧化硫臭味。

23 六．紫外吸收光谱法 （一）利用紫外特征吸收法 1．贝诺酯 最大吸收波长为240nm；吸收系数为730-760。
3．羟苯乙酯 羟苯乙酯乙醇溶液(5μg/ml)在259nm的波长处有最大吸收，吸收度为0.48。 4. 丙磺舒 在225nm与249nm处有最大吸收。 5. 布洛芬 在265nm与273nm的波长处有最大吸收，在245nm与271nm有最小吸收，在259nm有一肩峰。 6. 甲芬那酸 在279nm与350nm的波长处有最大吸收，其吸收度分别为0.69～0.74与0.59～0.60。

24 (二)利用双波长吸收度比法 1．对氨基水杨酸钠 于265±2nm波长处测定吸收度A265和A299,规定A265/A299的值应在1.15～1.56之间。 2．甲芬那酸 测定吸收度为A1/A2的值为1.15～1.30之间

25 七、红外吸收光谱法 红外吸收光谱是由分子振动和转动能级的跃迁所产生，它比紫外吸收光谱的专属性好。

26 第三节 特殊杂质检查 一、阿司匹林中特殊杂质的检查 杂质来源 原料残存（生产过程中乙酰化不完全）、水解产生（贮存过程中水解产生）
第三节 特殊杂质检查 一、阿司匹林中特殊杂质的检查 杂质来源 原料残存（生产过程中乙酰化不完全）、水解产生（贮存过程中水解产生） （一）、合成工艺

27 检查方法 对照法 反应原理 三氯化铁反应 限量 原料：0.1%； 阿司匹林片：0.3%； 阿司匹林肠溶片：1.5%； 阿司匹林栓：1.0%（HPLC法）

28 杂质碳酸钠试液中不溶，而阿斯匹林溶于碳酸钠试液。
（二）检查 除了“炽灼残渣”和“重金属”的检查外，有以下特殊杂质的检查项目： 1．溶液的澄清度：溶液的澄清度检查： 检查碳酸钠试液中不溶物 酚类（如苯酚） 醋酸苯酯 水杨酸苯酯 乙酰水杨酸苯酯 杂质碳酸钠试液中不溶，而阿斯匹林溶于碳酸钠试液。 2．水杨酸 生产中乙酰化不完全或贮藏过程中水解产生的水杨酸对人体有毒性，可呈淡黄，红棕甚至深棕色，使阿司匹林成品变色。 3．易炭化物 用重铬酸钾液0.25ml,比色用硫酸铜液0.40ml加水使成5ml比较，不得更深。

29 二．对氨基水杨酸钠中间氨基酚的检查 1、杂质来源 原料残存、脱羧产生 检查方法 2、ChP（2000） 含量测定法（双相滴定法）。
（一）合成工艺与间氨基酚杂质的产生 （二）双相滴定法与原理 1、杂质来源 原料残存、脱羧产生 检查方法 2、ChP（2000） 含量测定法（双相滴定法）。

30 ②遇热受潮生成间氨基酚,再被氧化成二苯醌型化合物
利用对氨基水杨酸钠不溶于乙醚，间氨基酚溶于乙醚的性质，使二者分离后，在乙醚中加水适量，用盐酸滴定，控制盐酸滴定液体积以控制间氨基酚限量。 USP（24） 离子对HPLC法（内标法） 杂质来源:①未反应完全的原料间氨基酚 ②遇热受潮生成间氨基酚,再被氧化成二苯醌型化合物 检查方法: ①双相滴定法(ChP2000) ②HPLC(USP23)

31 （三）高效液相色谱法 1.色谱条件 填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为磷酸二氢钠液/磷酸氢二钠溶液/甲醇[含氢氧化四丁基胺]，检测波长为254nm。 2.系统适用性试验 分离度应大于2.5 ，相对标准偏差不宜大于7% 3.按下式计算间氨基酚的含量 间氨基酚的百分含量=10(C/W)(Ru/Rs) 式中C为对照品溶液中间氨基酚的浓度（μg/ml），W为供试品溶液中对氨基水杨酸钠的含量（mg），Ru和Rs分别为供试品溶液和对照品溶液中间氨基酚峰与磺胺峰响应值之比。

32 反向离子对色谱是分离有机离子的有效方法，离子对试剂和其它添加剂的选用规则表明：
1. 样品中含有-COOH –SO3H基团时，选用的离子对试剂应是带正电荷的有机铵盐，以增加样品阴离子在反向色谱中的保留值，选用的流动相一般都为甲醇/水。 2. 除了加入离子对试剂外，还要加入磷酸盐或其他缓冲液，以控制流动相的酸度，而使这些酸性官能团获得解离。 3. 样品中含有-NH2 ，－NH－基团或其它阳离子时，选用的离子对试剂应是烷基磺酸盐或硫酸盐。 4. 样品中含有-NH2 ，–COOH ，–SO3H等不同性质的基团时，则1、2、3选用的试剂都合理。

33 三、 羟苯乙酯中有关物质的检查 供试品 对照品
羟苯乙酯中有关物质采用反向薄层色谱法，以供试品自身对照法进行有关物质的检查。化学键合硅胶为吸附剂，甲醇-水-冰醋酸为展开剂，在254nm紫外灯下检视溶液，1所得任何第二个斑点大小和强度不应超过溶液2的斑点。

34 判断： ① 控制杂质斑点个数，控制杂质种类 ② 供试品溶液所显杂质斑点不得深于对照溶液的主斑点（或荧光强度） 优点：以供试品的稀溶液作为对照液，不需要杂质对照品，简单、价廉，还可配成几种限量的对照溶液； 缺点：不同物质，不同Rf值比较，准确度差、直观性差。

35 讨论 反向薄层是物理结合和化学结合的。物理结合的固定相是用非极性溶液涂在硅胶等载体上而制得。固定液易流失，稳定性和重现性差。化学键合的固定相，是用化学键合反应，将有机基团键合到硅胶的的硅羟基上，是反向薄层色谱中应用最广泛的固定相。 化学键合相薄层板有以下特点： 1.能重复使用 2.重现性良好

36 四、甲芬那酸中特殊杂质的检查 （一）、合成工艺

37 （二）检查 1. “铜盐”检查法 （1）分光光度法 在435nm的波长处吸收度不得大于0.35。 （2）原子吸收分光光度法 2. 有关物质 （1）检查方法 以异丁醇-浓氨溶液（3:1）为展开剂，供试品溶液如显杂质斑点与对照液的主斑点比较，不得更深。其限量为0.2%。 JP（13）也采用薄层色谱法检查有关物质。 USP（24）和BP（1998）也都采用薄层色谱法检查。

38 五、氯贝丁酯中特殊杂质的检查 （一）、合成工艺

39 （二）、对氯酚的检查方法 1. 气相色谱法 甲基硅橡胶（SE-30）为固定液，涂布浓度为5%；柱温160℃；载气为氮气；检测器为氢火焰离子化检测器。 2. 高效液相色谱法[JP（13）的方法] 填料为氰基丙基硅烷化硅胶，柱温为室温；流动相为己烷-异丙醇-冰醋酸（1970:30:1）混合液；检测波长为275nm。 内标溶液 对-羟乙基酚的流动相溶液（ ）。 （三）、挥发性杂质的检查方法

40 第四节 含量测定 （一）直接滴定法 基于本类药物中游离羧基的酸性，可采用碱滴定液直接滴定。 pKa3～6

41 取本品，加中性乙醇，酚酞指示液，用氢氧化钠滴定液滴定，每1ml的氢氧化钠滴定液相当于18.02mg阿司匹林。
为防止阿司匹林时水解，致使测定结果偏高，故不用水溶剂，而用中性乙醇溶液溶解样品进行滴定。指示剂选用在碱性区变色的酚酞。 滴定应在不断振摇下稍快地进行，以防止局部碱度过大促使其水解。 供试品中所含水杨酸超过规定限度时，不宜用直接滴定法测定。

42 （1）测定方法及计算 Ka=3.27×10-4 反应摩尔比为1∶1 （2）讨论 缺点：酯键水解干扰（不断搅拌、快速滴定） 酸性杂质干扰（如水杨酸） ① 中性乙醇中性乙醇：①溶解供试品 ②防止酯水解。 目的：扣除乙醇中酸的影响。 ② 优点：简便、快速 ③ 适用范围：不能用于含水杨酸过高或制剂分析，只能用于合格原料药的含量测定 需做空白试验校正. 目的：NaOH在加热时易吸收CO2, 用酸回滴定会消耗酸，影响结果

43 （二）水解后剩余滴定法 1. 阿司匹林含量测定 利用阿司匹林酯结构在酸性溶液中易于水解的性质，加入定量的氢氧化钠滴定液，加热使酯水解，剩余的碱用酸溶液回滴。 USP（24）方法：取本品，加氢氧化钠滴定液混合，加酚酞指使液，用硫酸滴定液（0.25mol/L）滴定剩余的氢氧化钠，冰将滴定结果用空白试验校正。 碱液在受热时易吸收二氧化碳，故需在同样条件下进行空白试验校正。

44 两步滴定法适用于阿斯匹林片剂 片剂稳定剂:酒石酸或枸橼酸 分解产物:水杨酸和醋酸 第一步:中和 第二步:水解和测定

45 剩余滴定： 2NaOH（过量）＋H2SO4= Na2SO4＋2H2O 反应摩尔比为1∶2 优点：消除了酯键水解的干扰 缺点：酸性杂质干扰

46 2. 羟苯乙酯含量测定 　　具有羧酸酯，溶液中水解的性质，加定量过量的氢氧化钠滴定液，回流使酯水解，剩余的碱以硫酸回滴定。 由于碱液在受热时甚易吸收二氧化碳，故进行空白试验。

47 （三）两步滴定法 1. 阿司匹林片含量测定 　　片剂中除了加入少量酒石酸或枸橼酸稳定剂外，制剂工艺过程中又可能有水解产物（水杨酸，醋酸）产生，因此不能采用直接滴定法，而采用先中和供试品共存的酸，再将阿司匹林在碱性条件下水解后测定的两步滴定法。 中和 精密称取片粉适量，加中性乙醇，溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液，至溶液显粉红色。 水解与测定 在中和后，加定量过量的氢氧化钠滴定液，用硫酸滴定液滴定剩余的碱，结果用空白试验校正。

48 第一步 中和

49 第二步 水解后剩余滴定 水解：

50 剩余滴定： 2NaOH（过量）＋H2SO4 ＝Na2SO4＋2H2O 反应摩尔比为1∶1 本法消除了酸性杂质的干扰，降低了酯键水解的干扰
氯贝丁酯：消除供试品中共存的酸性杂质

51 2. 氯贝丁酯含量测定 为了消除供试品中共存的酸性杂质，在加热水解前，滴加氢氧化钠滴定液至中性（对酚酞指示液显中性）然后加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热回流水解，剩余的氢氧化钠用盐酸滴定液滴定，滴定结果用空白试验校正。

52 二、亚硝酸钠滴定法 对氨基水杨酸钠具有芳伯氨基，能发生重氮化反应

53 三、双相滴定法 苯甲酸钠易溶于水，可用盐酸滴定液滴定，滴定过程中析出的游离酸不溶于水，因此，利用苯甲酸能溶于有机溶剂的性质，在水相中加入与水不相混溶的有机溶剂，滴定过程中产生的苯甲酸不断萃取入有机溶剂层中。

54 如苯甲酸钠 ChP(2000) 溶剂：水——乙醚

55 乙醚的作用是：萃取反应生成的苯甲酸，使水相中的中和反应进行到底
滴定中要强力振摇。随着滴定不断进行，苯甲酸不断被萃取入有机溶剂层，使滴定反应完全，终点清晰。 优点：消除了反应产物的干扰

56 水相 乙醚相 滴定前：苯甲酸钠  甲基橙指示剂，呈黄色 （pH3.1~4.4）红 黄 滴定中：   苯甲酸钠+盐酸 苯甲酸 滴定终点：过量HCl， 使指示剂变橙红色

57 四、紫外分光光度法 （一）紫外分光光度法 BP（1998）亦采用吸收系数法在盐酸乙醇溶液中测定丙磺舒片剂的含量。
（二）离子交换-紫外分光光度法 离子交换树脂的预处理 烧杯中加入氢氧化钠溶液和强碱性聚苯乙烯阴离子交换树脂。用水洗涤树脂，红色石蕊试纸不变蓝色，最后用甲醇洗涤。

58 2. 阿司匹林的含量测定 对照品溶液的制备 供试品溶液的制备

59 五、高效液相色谱法 为了分离原料药和制剂中的杂质、辅料及稳定剂等，Ch.P(2000)采用高效液相色谱法测定阿司匹林栓剂；USP（24）采用高效液相色谱法测定阿司匹林片剂、长效与缓释片剂；以及对氨基水杨酸钠及其片剂、甲芬那酸及其胶囊、布洛芬及其片剂、口服混悬液、布洛芬盐酸伪麻黄碱片；丙磺舒等。

60 （一）阿司匹林栓剂的含量测定 色谱条件 填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-0.1%二乙胺水溶液-冰醋酸（40:60:4），检测波长为280nm，内标物质为咖啡因。 系统适用性试验 理论塔板数不低于2000，分离度大于1.5。

61 （二）丙磺舒原料的含量测定 色谱条件 填充剂为苯基键合硅胶，流动相为磷酸二氢钠的1%冰醋酸溶液；检测波长为254nm，流速0.1ml/min。 系统适用性试验 理论塔板数不低于3900，拖尾因子不大于2.3，对照品溶液重复进样五次，相对标准差不大于1.5%。

62 第五节 体内药物分析 一、血清中阿司匹林和水杨酸浓度的高效液相色谱测定法
第五节 体内药物分析 一、血清中阿司匹林和水杨酸浓度的高效液相色谱测定法 临床上已经确认低剂量服用可抑制血小板过度凝集的疾病，如心肌梗死和手术后的深部静脉血栓形成；并有预防缺血性脑血管病的作用，可采用反相高效液相色谱法快速、灵敏地测定人血清中ASA和SA的浓度。 色谱条件 填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-水-正丁醇（30:20:1） 内标溶液 　　　　 苯甲酸甲醇溶液 对照品溶液的制备 ASA和SA对照品适量 以对照品浓度为横坐标，峰高比为纵坐标 ASA和SA的线性范围分别为1g/ml～20g/ml和2g/ml～30g/ml。 回收率测定

63 实验结果表明，血清对照品混合样的色谱分离良好，保证了定量分析的准确性；本法仅需要血清100l，样品处理简便易行，不需要特殊的试剂和萃取步骤；测定一个样品约需15min。实测患者血清的结果也表明，本法可用于治疗药物浓度的检测。

64 二、尿中丙磺舒的固相萃取净化-高效液相色谱分析法
色谱条件 LiChrospher 100 RP 18(5m)，流动相为线性洗脱，零分钟为25%乙腈溶液-醋酸盐缓冲液，第6min时流动相为60%乙腈-醋酸盐缓冲液。 尿样的处理 线性关系和回收率测定 采用固相萃取技术净化丙磺舒尿样，样品预处理省时，回收率高，高效液相色谱分离时间在6min内。

65 三、HPLC法测定人血浆中布洛芬含量 色谱条件 Shim-pack CLC-ODS,预柱：YWG-C18；检测波长221nm；流动相：甲醇-20mol/L磷酸二氢钾缓冲液（70:30，PH=4.0），内标物：肉桂酸 供试品处理方法 取肝素抗凝的血浆，加内标溶液，振混匀，离心，取上清液进样。 线性关系 取空白血浆分别准确加入一定量的步洛芬对照品，以对照品浓度为横坐标，以峰高比为纵坐标，求出回归方程和相关系数。 步洛芬的线性范围为0.48g/ml~64.40g/ml。 平均回收率为99.2±1.6%。 精密度 日内RSD=1.8%，日间RSD=2.8%。 实验结果表明 血浆样品用甲醇除蛋白后，直接进样，且经预柱净化，再进入分析柱，使回收率高。高效液相色谱分离在6min之内完成，分离效果良好。