單源抗體製備與應用 李龍湖 國立中興大學獸醫學系教授 95年10月12日.

Presentation on theme: "單源抗體製備與應用 李龍湖 國立中興大學獸醫學系教授 95年10月12日."— Presentation transcript:

1 單源抗體製備與應用 李龍湖 國立中興大學獸醫學系教授 95年10月12日

2 抗體（Antibody, Ab） 抗原（Antigen, Ag） 半抗原（Hapten） 抗原決定位（Epitope）

3 單源（株、價）抗體（Monoclonal Ab） 抗原特異性抗體（monospecific Ab）
多價抗體（Polyclonal Ab） 抗體溶液中含有兩種以上不同抗體分子 單源（株、價）抗體（Monoclonal Ab） 抗體溶液中僅含一種抗體分子 抗原特異性抗體（monospecific Ab） 屬於多價抗體 抗體共同確認特定抗原

4 抗體特性比較 特性 單源抗體 多價抗體 抗原特異性抗體 特異性 高 低 高/低 濃度 供應限制 無 有

5 單 源 抗 體 發 展 背 景 1. B細胞 2. 骨髓瘤細胞（Myeloma cell, NS1, SP2）
‧脾臟或淋巴結之細胞培養約7天 ‧製造分泌標的抗體分子 2. 骨髓瘤細胞（Myeloma cell, NS1, SP2） ‧ B腫瘤細胞（自然發生） ‧製造分泌未知抗體分子 ‧可株化成株代細胞（cell line） 3. 細胞融合技術（cell fusion） ‧上述兩種細胞融合成融合瘤細胞（Hybridoma）

6 MAb製備流程圖

7 1. 細胞融合（脾臟細胞＋骨髓瘤細胞） 2. 陽性細胞株篩選與確認 抗原 BALB/C小白鼠 PEG融合劑
培養液（RPMI 1640, DMEM） HAT試藥 骨髓瘤細胞（NS1, SP2） 2. 陽性細胞株篩選與確認 ELISA IFA Western blot 雙重確認

8 3. 細胞株化 極限稀釋（Limited dilution） 餵飼細胞 陽性細胞再確認

9 4. 單源抗體定性 Isotype 鑑定 免疫沈澱（和抗原特異性結合） 抗體濃度 生物活性測定（如中和作用）
和抗原決定位結合（線狀或構型抗原決定位）

10 5. 單源抗體生產與純化 A 細胞上清液收集及抗體純化 抗體濃度低（小於 1 mg/ml） 不含胎牛血清培養液
B BALB/C 小白鼠生產抗體 Pristane處理，一週後注射融合瘤細胞 採集腹水，純化抗體 抗體濃度高（通常為數個 mg/ml）

11 6. 細胞保存和解凍 保存液含胎牛血清和抗凍劑10 % DMSO 連續降溫 溫度越低，保存越久 迅速解凍 隔天觀察生長情形及換液

12 7. 細胞污染或生長不良處理 黴漿菌污染 抗生素，抗黴菌劑使用 小鼠腹腔接種

13 單 源 抗 體 應 用 研究 治療：濃度高，動物使用多 免疫藥理學，免疫基治療等 檢驗試劑 : 病原 食品 藥（毒）物 蛋白質等

14 實 例 家禽Reovirus非結構蛋白σNS抗原決定位分析 細菌表現蛋白σNS 免疫 細胞融合 抗體篩選：ELISA，間接螢光抗體染色
實 例 家禽Reovirus非結構蛋白σNS抗原決定位分析 細菌表現蛋白σNS 免疫 細胞融合 抗體篩選：ELISA，間接螢光抗體染色 細胞株化及確認 抗體定性

15 Table1. Properties of monoclonal antibodies directed against the nonstructural protein σNS of ARV-S1133 *Concentration of ascitic immunoglobulin precipitated with ammonium sulfate was determined according to Bio-Rad Standard Assay Procedures.

16 N: Native σNS PC: Polyclonal antibody
D: Denature σNS NC: Normal control serum

17 V: Virus-infected cell extracts
C: Mock-infected cell extracts 1 to 10: Immunoprecipitates with MAbs 1: 47C, : 4A21, 3: 4A125, 4: 4A23, 5: 1F9, : 4B9, 7: Gall, : 4A123, 9: 5F9, 10: H1E1

18

19

20 A: OD without a competiting Ab B: OD with a homologous Ab
Competition (%) = ( ) 100% A: OD without a competiting Ab B: OD with a homologous Ab n: OD with a competitor A – n A – B

21

22 Table2. Results of competitive binding assay between monoclonal antibodies to ARV-S1133 nonstructural proteinσNS Competition more than 60%, ++; competition between 35% and 60%, +; competition less than 35%, -. Epitope recognized by MAbs 5F9 and Ga11 was not classified (U).

23

24 1. Poly(A)-sepharose + σNS 2. σNS + MAbs (1:5)
3. σNS + MAbs (1:500) σNS + MAbs (1:5000) 5. Normal serum + σNS σNS + anti-σNS Ab 7. Sepharose + σNS Sepharose + σNS + MAb1F9

25 MAb capture ELISA for detecting Ab to ARV σNS MAb 1E1
Antigen 1. Expressed ARV σNS (eσNS ) Coating MAb + Crude eσNS preparation Coating purified eσNS 2. Virus-infected CEF lysate Coating MAb + cell lysate Coating cell lysate 3. Conventional ELISA

26 MAb capture ELISA (crude eσNS preparation)