酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性

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1 酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性

2 常见电泳技术 按支持介质的不同可分为： 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel-electrophoresis） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法） 按支持介质形状不同可它为： 薄层电泳 板电泳 柱电泳

3 电泳设备 垂直电泳系统

4 水平电泳系统

5 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺(N,N ′ -methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 催化剂 丙烯酰胺 N,N′-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺

6 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；
对pH和温度变化较稳定； 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

7 SDS－PAGE的原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。

8 不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图

9 不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的 蛋白质混合物分离能力的关系
5％ 10％ 15％ 29 45 66 97 200

10 肿瘤细胞的侵袭移动 C B A D 肿瘤细胞侵袭是指肿瘤细胞粘附并穿越细胞外基质，包括三个重要的步骤：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，细胞经缺口移动。 肿瘤细胞对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞转移的关键步骤。 转移的肿瘤细胞在原灶外存活和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。

11 细胞间基质结构示意图 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要成份由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖组成。
ECM在上皮或内皮细胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存在，在细胞间结构以间质结缔组织(interstitial connective tissue)形式存在。 胶原是ECM的主要成分，目前已发现，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ型胶原是间质结缔组织中的主要成分。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。

12 肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。
虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。 肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金属蛋白酶(metalproteinase, MMP)类，如胶原酶IV、基质降解酶、透明质酸酶。

13 基质金属蛋白酶蛋白家族 MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨基酸序列的同源性分为三大类： （1）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间质胶原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原, 但不能降解明胶和Ⅳ型胶原； （2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)，间充质溶解素对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原酶以及Ⅰ型胶原的氨基端。 通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。

14 MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量为72kDa。
MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。 中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在细胞内存在形式时发现的，它能够与MMP-9聚合形成异源二聚体，保护和调节MMP-9活性，从而促进恶变细胞的浸润和转移。 检测MMP-9和MMP-2的活性，对分析肿瘤细胞恶性程度和预后提供帮助。

15 NGAL的三级结构 由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中间的和中间的八段反平行的β折叠所构成，这八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构。 此β折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的N 端310螺旋所封闭。在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。

16 MMP-2的结构 Pre: 信号肽序列 Pro: 带巯基的前肽 Zn: Zn离子结合部分 II: 能结合胶原的II型纤维结合素结构域
H: 绞链区 Hemopexin：类血红素蛋白结构，由四段重复序列组成，其中第一个与第四个间存在一 个二硫键。

17 MMP-9的结构 由三个α螺旋与5个β折叠构成 含有2个锌离子和5个钙离子 右图可见一个小分子化合物位于酶活性中心，并与一个锌离子结合

18 NGAL能与MMP-9以二硫键的方式结合，能起到保护和调节MMP-9功能的作用，所以NGAL与肿瘤的侵袭移动有密切的联系。
汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组以转染有pcDNA3 空白质粒载体的SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测结果表明，转染有pcDNA-NGAL (-) 的SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显降低；而与此同时，转染有pcDNA-NGAL (＋) 的SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显升高。表明通过有义、反义技术使NGAL 基因表达发生改变可以对SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2 的活性产生明显影响。 M：蛋白marker；1. 细胞培养基；2. pcDNA3；3. pcDNA-NGAL ( + )；4. pcDNA-NGAL ( - )

19 实验原理 MMP-2和MMP-9活性的强弱与肿瘤浸润和转移的能力密切相关。明胶是这两种酶的底物。所以在体外通过酶谱法（Zymography）检测样品（组织，细胞培养液，血清，血浆，尿）中MMP-2和MMP-9的活性，对了解肿瘤细胞的恶性程度、监测治疗效果和评价预后具有重要的指导意义。 酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

20 实验操作 样品制备: 血清、血浆和尿样品可取适量直接与2×SDS 样品缓冲液等体积混匀进行下一步实验，如酶活性太高造成显带不理想，可适当进行稀释; 凝胶的制备: 玻璃板对齐后放入夹中垂直卡紧。按表格配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，灌胶时，可用5ml加样枪吸取凝胶沿玻璃板加进去，然后胶上加一层异丙醇，以隔离空气中的氧，促进凝胶聚合（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时凝胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡）。约几分钟后当异丙醇和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面表格配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出;

21 在每个加样孔中加入10 µl样品; 电泳： 在4℃ 100V下，约2h; 凝胶的处理： （1）电泳结束后，取下凝胶，放入平皿中，用洗涤缓冲液在室温摇动下洗涤1h，其间换液一次； （2）弃去洗涤缓冲液，然后加入孵育缓冲液没过胶面，至37℃恒温箱中，24h后取出； （3）弃去孵育缓冲液，加入0.1%考马斯亮蓝染液染色约30min，回收染液，加入脱色液脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5％乙酸中止脱色； （4）待凝胶在5％乙酸中恢复到适当大小后，用凝胶图象处理系统分析结果，以白色条带的净光密度值相对定量样品中酶活性。

22 预期实验结果 N N P P 135kD 92kD 72kD NGAL/MMP-9 Pro-MMP-2 MMP-9