第23章 病毒感染的实验室 诊断技术.

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1 第23章 病毒感染的实验室 诊断技术

2 主 要 内 容 第一节 标本的采集、处理与运送 第二节 病毒形态学检查 第三节 病毒的分离与鉴定 第四节 病毒的血清学检测
主 要 内 容 第一节 标本的采集、处理与运送 第二节 病毒形态学检查 第三节 病毒的分离与鉴定 第四节 病毒的血清学检测 第五节 病毒的分子生物学检测 第六节 病毒感染的快速诊断 THE END

3 第一节 标本的采集、处理与运送 一、标本的采集、处理 （一）采集样本的时间 （二）标本种类的选择
在发病初期（急性期）采取较易检出病毒，越迟阳性率越低。 （二）标本种类的选择 1.呼吸道感染 2.肠道感染 3.中枢神经系统感染 4.其他感染

4 （三）常见标本的采集方法和用途 1．血液 7．脑脊液标本 2．粪便标本 8．眼拭子标本 3．尿道拭子及尿液标本 9．宫颈或阴道拭子
4．鼻拭子和咽拭子 5．喉拭子 6．含漱液标本 7．脑脊液标本 8．眼拭子标本 9．宫颈或阴道拭子 10．疱疹液标本 11．各种活检和尸检标本

5 （四）标本的处理 1．血液标本 2．粪便标本 3．鼻、咽拭子标本 4．尿标本 5．疱疹液 6．脑脊液 7．组织标本

6 二、标本的运送和保存 病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，如实验室距离较远或一时无法立即传送时，应将标本放入装有冰块的冰壶内尽快送检。 大多数病毒对甘油有抵抗力，送检的组织、粪便标本等可置于含抗生素的50%甘油缓冲盐水中，低温下保存送检。 最好在标本采取后1~2h内送到实验室，立即进行检查或分离培养。暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。

7 第二节 病毒形态学检查 一、形态学检查 （一）光学显微镜 （二）电子显微镜检查法 1、电镜直接检查法 2、免疫电镜检查法
第二节 病毒形态学检查 一、形态学检查 （一）光学显微镜 （二）电子显微镜检查法 1、电镜直接检查法 2、免疫电镜检查法 （三）X线晶体衍射法

8 二、病毒大小的测定 （一）电子显微镜直接测量 （二）超过滤法 （三）超速离心法

9 第三节 病毒的分离与鉴定 一、病毒分离和鉴定的一般程序 CPE EM 空斑试验 包涵体 临床标本的收集 标本处理后接种 新生小鼠 组织 鸡胚
第三节 病毒的分离与鉴定 一、病毒分离和鉴定的一般程序 临床标本的收集 标本处理后接种 新生小鼠 组织 鸡胚 收获尿囊液、 羊膜腔液 红细胞凝集试验 CPE 红细胞吸附 空斑试验 包涵体 EM 观察发病

10 二、病毒的分离与鉴定 （一）病毒分离培养 1．动物接种 2．鸡胚培养

11 3．组织培养 （1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变
2）红细胞吸附（hemadsorption） 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变

12 （二）病毒的数量与感染性测定 （三）新分离病毒的鉴定 1．蚀斑（plaque）测定
蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU） 2．50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定 （三）新分离病毒的鉴定 1．病毒核酸类型的测定 2．理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3．血清学鉴定

13 第四节 病毒的血清学检测 一、中和试验 （一）原理 （二）用途 二、补体结合试验 （一）原理 （二）用途

14 三、血凝及血凝抑制试验 （一）原理 （二）用途 四、凝胶免疫扩散试验 （一）原理 （二）用途

15 第五节 病毒的分子生物学检测 一、分子杂交技术 （三）常用的杂交方法 （一）基本原理 （二）主要步骤
第五节 病毒的分子生物学检测 一、分子杂交技术 （一）基本原理 （二）主要步骤 样品处理、探针的制备 、预杂交 、杂交 、漂洗、检测 （三）常用的杂交方法 1．斑点杂交(spot b1ot hybridization) 2．固相杂交技术 3．原位分子杂交（in site hybridization） 4．Southern印迹和 Northern印迹法 5．分支DNA（branched DNA, bDNA）技术

16 二、聚合酶链反应 （polymerase chain reaction, PCR）
（一）基本原理 （二）主要步骤 1.模板的制备 2.反应体系的组成：缓冲液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、模板 3．扩增： 变性→复性 →延伸 4．产物分析 （三）常用技术 巢式（nested）和半巢式（hemi-nested）PCR、原位PCR（site PCR）、逆转录PCR（revere transcriptive PCR, RT-PCR） 、多重PCR（multiple PCR）、RNA捕获PCR(RNA captured PCR)、免疫PCR（immune PCR）、定量PCR（ration PCR）

17 三、凝胶电泳技术 （一）基本原理 （二）常用方法 1．琼脂糖凝胶电泳 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳

18 第6节 病毒感染的快速诊断 一、形态学检查 （二）固相放射免疫测定 （三）酶免疫技术 （四）其他技术 三、早期抗体检测 四、病毒核酸检测
二、病毒抗原的检测 （一）免疫荧光技术 （二）固相放射免疫测定 （三）酶免疫技术 （四）其他技术 三、早期抗体检测 四、病毒核酸检测

19 THE END