PCR Enzymes的选用 袁 晓东 李 晶泉 汤 敏谦 宝生物工程（大连）有限公司，116600.

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1 PCR Enzymes的选用 袁 晓东 李 晶泉 汤 敏谦 宝生物工程（大连）有限公司，116600

2 讲 座 内 容 Ⅰ）PCR概论 Ⅱ）TaKaRa PCR Enzymes Ⅲ）实验精选

3 Ⅰ） PCR 概 论

4 PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理

5 PCR法的操作过程 Step 1: DNA热变性 Step 2: 引物退火 Step 3: 引物延伸

6 PCR存在的问题 1.可信度（Fidelity）：PCR反应过程中的错配 （Misincorporation）现象，给PCR克隆、变异导入
带来麻烦。 2.扩增的DNA长度：一般扩增1～2 kbp以下的DNA片段。 3.扩增的DNA量：对有些检测、克隆时，DNA量往往达 不到要求。 4. PCR扩增困难：当DNA富含GC或具有复杂二级结构时， PCR很难扩增。 5.PCR反应速度：当急于得到实验结果时，PCR反应速 度较慢。

7 LA PCR 技术的应用 ●LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术的关键是使用具有3’→5’ Exonuclease活性（Proof reading活性）的耐热性DNA聚 合酶。原理见右图。

8 Ⅱ）TaKaRa PCR Enzymes 1.TaKaRa TaqTM 2.TaKaRa Ex TaqTM
3.TaKaRa LA TaqTM 4.PyrobestTM DNA Polymerase 5.TaKaRa Z-TaqTM

9 PCR Enzymes 的选用

10 TaKaRa TaqTM ●特点 1. 进行1～2 kbp以下的DNA片段的PCR扩增。 2. 比较经济的PCR用DNA聚合酶。

11 TaKaRa TaqTM 扩增例

12 TaKaRa Ex TaqTM ●特点 1. 进行15 kbp以下的DNA片段的PCR扩增。 2. 融合了LA PCR技术。
3. 可信度是TaKaRa TaqTM 的3～4倍。 4. 从扩增灵敏度、扩增量、PCR条件的通 用性考虑，是一种万能型PCR用DNA 聚合酶。

13 TaKaRa Ex TaqTM 扩增例

14 TaKaRa LA TaqTM ●特点 1. 进行10 kbp以上的DNA片段的PCR扩增。 2. 融合了LA PCR技术。
3. 可信度是TaKaRa TaqTM 的7倍。 4. 适用于扩增具有GC rich或复杂的二级 结构的DNA（使用GC Buffer）。

15 TaKaRa LA TaqTM 扩增例

16 TaKaRa LA TaqTM With GC Buffer 扩增例
●扩增262 bp（GC含量73%）及385 bp（GC含量72%）的DNA片段

17 PyrobestTM DNA Polymerase
●特点 1.高保真性（High Fidelity）。和Pfu、Vent DNA聚合酶相同，可信度是TaKaRa TaqTM的10倍以上。 2.良好的扩增性能。和TaKaRa TaqTM有相同的扩增性能（优于 Pfu、Vent DNA聚 合酶）。

18 DNA Polymerase的可信度比较

19 PyrobestTM DNA Polymerase的扩增效率

20 TaKaRa Z-TaqTM ●特点 反应速度快，是TaKaRa TaqTM的5倍。 扩增性能良好，和TaKaRa Ex TaqTM 相同。

21 TaKaRa Z-TaqTM的快速性

22 TaKaRa Z-TaqTM 的扩增效率

23 TaKaRa PCR Enzymes 的性能比较

24 PCR Premix系列产品 *模板：λDNA

25 Ⅲ）实 验 精 选（一） ●血液样本的直接PCR扩增

26 血液样本的PCR直接扩增 摘 要 由于血液中含有大量的遗传、生物信息，因此血液的检测、研究十分广泛。而血液中各种物质丰富，并含有很多酶反应的阻碍物质，当进行PCR反应时，一般先须提取血液中的DNA。这样，在处理 大量血样时，操作繁锁，并容易出差错。 本研究使用反应性能良好的TaKaRa Ex TaqTM酶， 对各种血样直接进行PCR反应时的条件进行了研讨。

27 使用的血样种类及PCR扩增片段 ●对三种抗凝固剂处理血样进行了实验。 ●扩增的DNA片段 肝素处理血样。 EDTA处理血样。
柠檬酸钠处理血样。 ●扩增的DNA片段 扩增人体染色体DNA的Cytokeration（细胞角蛋白） 19领域中的663 bp的DNA片段。

28 PCR 扩 增 1. PCR反应液组成 2. PCR反应条件 10×Ex Taq Buffer dNTPs (各2.5 mM)
Primer 1 (20 pmol/ml) Primer 2 (20 pmol/ml) TaKaRa Ex TaqTM (5 U/ml) 血液样本 dH2O up to 5 ml 4 ml 0.5 ml 0.25 ml 1～5 ml 50 ml 94℃, 4.5 min 94℃, 30 sec 55℃, 1 min 35 Cycles 72℃, 1 min 72℃, 5 min

29 PCR反应结果

30 肝素处理血样的PCR直接扩增 肝素是酶的活性阻碍剂。实验结果证明：肝素处理血样难以直接进行PCR扩增。为此，我们作了进一步研讨。
方法是：在PCR反应体系中加入肝素酶I，用以降解肝素。

31 肝素处理血样的PCR扩增 1. PCR反应液组成 2. PCR反应条件 10×Ex Taq Buffer dNTPs (各2.5 mM)
Primer 1 (20 pmol/ml) Primer 2 (20 pmol/ml) TaKaRa Ex TaqTM (5 U/ml) 血液样本 肝素酶 I (0.5 U/ ml) dH2O up to 5 ml 4 ml 0.5 ml 0.25 ml 1～5 ml 1 ml 50 ml 30℃, 30 min (肝素酶Ⅰ的前处理) 94℃, 4.5 min 94℃, 30 sec 55℃, 1 min 35 Cycles 72℃, 1 min 72℃, 5 min

32 肝素处理血样的PCR反应结果

33 血样直接PCR可能扩增的DNA片段长度 1. 使用血样 2. 扩增模板的种类及DNA片段的长度 3. PCR扩增条件
使用1 ml的EDTA及肝素处理的血样。 2. 扩增模板的种类及DNA片段的长度 β-Globin： 205 bp,262 bp,325 bp, 1292 bp,1387 bp,1450 bp GAPDH ： 484 bp CK ： 663 bp H-ras ： bp 3. PCR扩增条件 分别遵循EDTA、肝素处理血时的PCR扩增条件。

34 PCR扩增结果 M M M M M:100 bp DNA Ladder

35 结 论 三种抗凝固剂（肝素、EDTA、柠檬酸钠）处理的血样取1 ml均可进行PCR扩增。其中EDTA处理血样的反应性能最好；而肝素处理血样进行PCR时， 须在反应体系中入肝素酶 I。 2.PCR扩增的DNA片段长度以500 bp以下为佳，1000 bp以上的DNA片段难以进 行扩增。

36 Ⅲ）实 验 精 选（二） ●转基因作物（GMO）的检测

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42 谢谢！