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Pull-down assay (His-Tag or GST-Tag)
一.實驗原理:
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Pull-down assay (His-Tag or GST-Tag)
二.實驗流程: Incubate (target protein and GST/His tag fused protein) protein conc and final volume : 1-20 μM , 500 μl temp and time : 4˚C for 4-24 hours Incubate Using spin column or beads: Incubate 3 ~ 5min 後離心 ( rpm) 去掉上清液 Load into beads Wash 5 min 後離心 ( rpm) 去掉上清液 重複wash 3-5次 (volume : 500 μl) Wash Elute 使用Elution buffer 將target protein洗下來 Volume : 120μl Analysis 使用SDS-PAGE or western blot 分析結果
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Pull-down assay (His-Tag or GST-Tag)
三.注意事項: 1.此實驗進行時需要許多控制組，避免一些非特定的結合的蛋白質影響我們對實驗結果的判斷，下圖為該設計的控制組。 測試GST-A protein是否會與Beads結合 測試Target B protein 是否會與Beads非特定結合 測試GST是否會與Beads結合 1 2 3 4 ５ GST + - GST-A protein Target B protein 測試Target B protein 是否會與GST 非特定結合 測試GST-A protein 是否會與Target B protein 結合 2.使用SDS-PAGE 以及Western blot 分析時，所有的樣品皆需要分析，包含一開始與beads 結合後以及wash 後所取出的上清液，有助於分析實驗結過以及在設計實驗。
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