DNA的提取 田秀君.

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1 DNA的提取 田秀君

2 鉴于从现场收集的麻风标本多为全血，皮肤活检标本，鼻拭子，因此着重介绍从全血，皮肤活检标本中提取DNA的方法。

3 实验一 皮肤组织中的DNA的提取

4 实验目的：掌握从皮肤组织中提取麻风基因组DNA的方法
原理及应用：麻风基因组DNA通常先用SDS裂解，蛋白酶K消化细胞，利用酚，酚/氯仿抽提纯化，经异丙醇或乙醇沉淀，获得基因组DNA。适用于PCR扩增，Southern分析等实验。

5 商品化的试剂盒不需要酚/氯仿纯化，乙醇沉淀，而是将皮肤组织经裂解液裂解，将裂解后的液体进入含硅藻滤膜的纯化柱，基因组DNA被吸附，洗液穿过纯化柱被抽走。这种方法具有快速，简便，安全的优势。

6 方法一： 使用商品化的试剂盒提取基因组DNA

7 实验材料 一 试剂盒成分:QIAamp DNA Blood Mini Kit
本实验使用量 QIAamp Spin Column 1个 Collection Tubes 2个 Buffer ATL 180ul Buffer AW1 500ul Buffer AW2 Buffer AE 100ul QIAGEN Proteinase K 20ul

8 二， 其他试剂，仪器及耗材 1.5ml的离心管 旋涡混合器 55℃ 水浴箱 台式离心机（14000 rpm) 96-100%乙醇
0.8%琼脂糖凝胶及电泳装置

9 实验步骤 准备样本 将皮肤组织标本从70%的酒精中取出，放入1 ×TE中浸泡1小时，取出后用消毒的剪刀，镊子将其剪成肉泥状。

10 消化样本 将肉泥状的皮肤组织放入EP管中，加入消化液ATL180ul和蛋白酶K20ul,55 ℃消化大约72h，期间用旋涡混合器振荡混合助溶。消化好的样本成清亮透明。

11 加入200ul的溶液AL，旋涡混合均匀 70 ℃孵育10min,加热灭活蛋白酶K 加入200ul的（96-100%）的乙醇，旋涡混合数秒
轻轻的将离心管内的混合物转移到 离心柱内（切勿接触到离心柱沿）， 盖上管盖，8000rpm离心1分钟

12 将离心柱置于一个干净的2ml 收集管内， 将含有过滤物的旧管丢弃 加入500ul的溶液AW1， 8000rpm离心1分钟

13 加入500ul的溶液AW2， 14000rpm离心3分钟 将离心柱置于一个干净的2ml 收集管内， 将含有过滤物的旧管丢弃

14 洗脱基因组DNA 将离心柱置于一个干净的1.5ml 的离心管内， 将含有过滤物的旧管丢弃 加50ul的溶液AE 室温孵育5分钟

15 8000rpm离心1分钟 离心后的管底溶液即为所提取的DNA 检测：琼脂糖凝胶电泳法观察基因组DNA

16 实验二 从全血中提取DNA

17 实验目的：掌握从人的全血中提取基因组DNA的方法。
原理及应用：大体与从皮肤组织中提取的原理及应用相同。

18 实验材料 一 试剂盒成分:DNeasy Tissue Kit
本实验使用量 QIAamp Spin Column 1个 Collection Tubes 2个 Buffer AL 200ul Buffer AW1 500ul Buffer AW2 Buffer AE 100ul QIAGEN Protease 20ul

19 实验步骤 （一）准备样本 将冻存在-40 ℃的样本取出，在37 ℃水浴中迅速解冻，融化。

20 离心法纯化基因组DNA 在1.5ml 的离心管底加入20ul的蛋白酶 在离心管中加入200ul的全血
再加入200ul的溶液AL，旋涡混合15秒 56℃孵育10分钟

21 瞬时离心将离心管盖上的样品甩下来 加入200ul的（96-100%）的乙醇， 旋涡混合15秒。瞬时离心。 下述步骤同从皮肤组织中提取DNA

22 提取鼻拭子DNA的方法 刘健

23 将Ep管放入4°C冰箱静置4-6小时 从冰箱中取出Ep管，挤干鼻拭子 的水分，并弃去鼻拭子 在1.5ml Ep管中放入500ul PBST

24 加入50ul 0.1M的Tris-Hcl/EDTA，
将Ep管放入4°C离心机， 离心20min，13000转 取出Ep管，小心地吸去 上清，保留沉淀 加入50ul 0.1M的Tris-Hcl/EDTA， 反复冻融（-40°C---90°C）3次 加入10ul 20ug/ml蛋白酶K， 在56°C水浴箱中孵育过夜

25 在放入100°C中灭活10min 放入-20°C冰箱中保存