基因的克隆与表达.

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1 基因的克隆与表达

2 基因表达(gene expression)
基因克隆(gene cloning) 基因表达(gene expression) -原核基因表达 -真核基因表达

3 基 因 克 隆 Gene Cloning

4 概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程

5 一、概述 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理
提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码

6 1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌 所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞

7 基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。

8 基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。

9 基因克隆的技术路线 目的基因 载体 体外重组 重组子（杂合DNA） 转化 受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA

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11 复制基因(replicator) 选择性记号 克隆位点
二、克隆载体 复制基因(replicator) 选择性记号 克隆位点

12 三、受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性

13 四、体外重组的策略 1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 最方便简单 高背景-载体自身环化 双向插入

14 2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略
粘-粘连接：最有效、最快捷 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平

15 2、平末端连接： 酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA 效率低，酶用量大

16 3、人工接头连接 人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段

17 4、T-A克隆 T-vector两条链的5’端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A

18 五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 1、直接分离 3、构建cDNA文库 4、PCR 5、人工合成 6、差异显示

19 1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库

20 2、构建基因组文库，筛选目的基因 基因组文库(gene library)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。

21 构建流程 抽提基因组DNA 鸟枪法制备DNA片段 DNA片段与载体重组 转化宿主菌 筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）

22 特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况

23 3、构建cDNA文库，筛选目的基因 cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。

24 cDNA文库仅包含正在表达的基因 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 基因总量少，易筛选

25 4、PCR扩增目的基因片段 适用于克隆序列清楚的基因 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法

26 5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因

27 （二）体外重组 连接体系的建立： 温度：粘末端连接：12-18℃ 平末端连接：室温（低于30℃) DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3 酶量：平端连接时需加大酶量

28 （三）转化—Cacl2法、电击法 （四）重组子的筛选及鉴定 1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑） 原位杂交 2、鉴定： 长度鉴定：酶切、PCR 方向鉴定：联合酶切 测序

29 基因的表达 Gene Expression

30 一．表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。

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32 据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。

33 二．原核生物基因结构和表达特点

34 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。
原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。

35 3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。

36 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位

37 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。
共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因

38 5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子

39 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区：

40 RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录
各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列

41 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列

42 6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点
转译起始密码子AUG 或GUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列

43 三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：
删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解

44 四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：
1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。

45 常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。

46 2、基因剂量： 3、核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。 AUG—SD间距离。 AUG后的核苷酸

47 五．原核表达载体：  适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。
主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因

48 类型： 融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙

49 （一）融合型表达载体 Foreign DNA P SD 融合型表达载体 融合基因

50 技术关键：克隆基因插入原核序列3’端而维持正确阅读框架。
选择合适酶切位点 加人工合成的DNA接头 构建位相载体

51 载体部分序列 DNA序列 ----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT ---
BamHI EcoRI ----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT --- ----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA--- DNA序列 AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA

52 位相载体----含有3种读码框的系列载体

53 优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性

54 融合型载体----pGEX系列 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1T—凝血酶
pGEX-3T---X因子 位相载体

55 （二）非融合型表达载体 Foreign DNA P SD 非融合型表达载体 非融合基因

56 主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子

57 非融合型表达载体----pPL-Lamda
插入位点--HpaI

58 （三）分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。

59 分泌型表达载体----pINIII-ompA1

60 分泌型融合表达载体----pEZZ18

61 六．提高表达水平的手段 1、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子----提高转录水平 核糖体结合位点（ATG---SD） 避免产物降解 ：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂

62 2、选择合适宿主 Lac 启动子----LacI菌 PL/PR CI 溶源菌

63 3、诱导表达 温度诱导------PLPR / IPTG的化学诱导----Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解

64 七．表达产物的检测： 1、特异性鉴定： 荧光抗体法 免疫沉淀法 免疫印迹法 ELISA 2、生物学活性鉴定

65 八、原核表达系统的缺点 1、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子 2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工

66 真核表达系统的必要性及优势 1. 具转录后加工系统 2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达 4.基因治疗

67 真核基因结构及表达调控特点 （一）真核基因组的复杂性 真核基因组庞大，具大量非编码序列 ---mRNA丰度不同 结构复杂：染色质、核膜、线粒体---表达调控多样 不连续性：内含子、外显子 没有操纵子结构

68 (二）真核表达系统 组成：真核表达载体 受体细胞 基因转移方式

69 据受体细胞及表达载体的不同分为3种： 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统

70 （三）转化 1、原生质体法：去除厚壁 2、电穿孔法：效率较高

71 （四）外源基因的表达 1、胞内表达 2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列

72 （五）缺点 不能实现全部的翻译后修饰功能