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微生物生物技術 葡萄王生技股份有限公司 陳勁初
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應用微生物 發酵學
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I.菌種管理 a.來源: I. 食研所生資中心(BCRC) II. 中國科學研究院 III.上海農業科學研究院 IV. 自行篩選分離
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b.保存: I.冷凍保存 : -20℃ -80℃ -196℃ II.繼代培養 : 小米(麥)粒 斜面 礦物油
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c.確認: I. 柯霍法測 II. DNA (18S rDNA) III.委託鑑定
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V. Chemical finger print VI. Contamination : Yeast . Bacteria . Mold
I. Enzyme : API Zym II. Culture : API CH50 III. DNA : RFLP IV. Flavor & Pigment V. Chemical finger print VI. Contamination : Yeast . Bacteria . Mold
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API Zym
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API CH50
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DNA : RFLP M As As2 Ac wAc As As2 Ac wAc M
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Flavor & Pigment
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Chemical finger print Ac -凍-MeOH萃
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II.種菌製備 I. Fresh , nutritious , adaptive II. PDA , MA , YM , TSA / pH
III. Refresh by pour plates IV. Pick single colony
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I. Goose-neck bottle test II. Sterilization time from hot or
b. 2L Hinton flask : I. Goose-neck bottle test II. Sterilization time from hot or cool point III. Cooling in autoclave IV. Loop , not tip V. Cap and inoculum practice VI. Shear stress
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三角瓶培養管理 澄清試驗: Exclude bacteria & yeast Plate test: exclude mold
Active mycelium vs. inactive mycelium check with microscope
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Table .Actual cycle time (121C,saturated steam)
Required to sterilize materials an autoclave Material Time(min) Erlenmeyer flasks 2000 ml ……………………………… 1000 ml ……………………………… 20-25 500 ml ……………………………… 200 ml ……………………………… 125 ml ……………………………… “Square-Pak”Pyrex Flase,1000 ml ……30-35 Serum bottle, 9000 ml …………………50-55 Milk dilution bottle, 100 ml ……………3-17 Test tubes 18 by 150 mm …………………………12-14 32 by 200 mm …………………………13-17 38 by 200 mm …………………………15-20
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c. 100L ~500L ferementor ： I. Agitation or air-lift II. Mycelium pellet III. Clearance IV. In laminar flow V. Microscope check after pouring out before inoculum
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發酵培養 a. Steps越少越好 b. Seed 愈年輕越好 c. Antifoam 事先探討 d. Shear stress 判斷與降低
e. Adaptive culture : e g. SO2 / wine, beer / 9℃ ,主發酵之趨近
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發酵培養 衰亡期之判斷: Ⅰ. 菌體活性低,胞內顆粒多,出現液泡, 菌體膨大或不規則(methylene blue)
Ⅱ. 自溶現象, 產孢現象. Ⅲ. 二次代謝物之產生. Ⅳ. 二次生長現象 : 2 種 C or N. sources.
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百升級管理 CIP 接菌槽設計 Log phase~ early stationary phase
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III.主發酵 I. Cheap , convenient , easy-treated
a. Medium : I. Cheap , convenient , easy-treated II. Chemicals excluded out III. Cl , antibiotic survival b. Log phase seed:
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噸級管理 (2-5T) CIP Sparging hole Plate assay Microscope Foaming
Bioassay and chemical assay
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c. Separation ? Concentration ? Dryness ? Milling? d. Contamination ?
IV.收槽 a. When ? 1° or 2° metabolites b. How ? Boiling ? c. Separation ? Concentration ? Dryness ? Milling? d. Contamination ? e. Capacity of down-stream
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Downstream Boiling Conc. : over night F. Dry: over night / bag-packing
Milling into powder
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V.QC a. Functional ingredients b. Safety c. E.coli , coliform ?
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VI. 敗槽 a.菌相確認. b.耐熱性測試. c.耐熱菌之處理：如前所述. 非耐熱菌之處理：無菌測試.
O.K ：接種種菌，tank，pipe，laminar flow Not O.K ：槽內焊縫，filter air，壓力測試. 蛇管/排管，無縫管.
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成品管理 Particle size Moisture & hygroscopic 流動性 微生物檢測
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VI.規劃 a. Down steam設備 比fermentor 貴很多，且越大越貴. b.依製程規劃，使閒置越少越佳.
c.勿一次投入太大，營業部門常過分樂觀. d.料方便，人方便，GMP規劃. e.多槽對多槽方式，彈性大.
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VII.應用 產業界各種微生物發酵代工 樟芝、靈芝、雲芝、 桑黃、白樺耳 、巴西蘑菇、蟲草、蛹蟲草、舞茸、猴頭菇
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菌種的篩選 1.菌的特性:Bacteria. Yeast . Mold. (Yeast-like mold)
a. pH: growth & germination limit b. temp: c. Aw: d. thermotolerance : spore & germination e. Juice & milk. f. soft drink & water g. Nutrient requirement: biotin for S. cerevisiae for C. glutamioum
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菌種的篩選 2. Screen: a. Lab mixture : yogurt
b. Yeast / mold mixture : anka. Beka c. Bacteria / mold : cheese d. Lab / Yeast : Kefir e. 藻類/bacteria : 綠藻池 f: eppendorf slant for wild mushroom collection.
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菌種的篩選 g: functional screen : amylase. Protease. chitinase.
phytase. lysine. Antibiotics. Streptovidin (avidin). rec assay. Analog assay. Surfactant / 羊血 3.採樣 : a. soil sample : Bacteria(108), streptomyces(107), mold(106), Yeast(105),algae(104),protoza(103)/g (1)耕土 , 草地: B. s, 山坡土落葉多: M. r., 沙土(乾):s (2)植被 : 蕃茄地/ vit. c 生產菌 葡萄地/ Yeast 豆科/根瘤菌 銀杏林/ Actimomyces
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菌種的篩選 (3)太空包,森林 : 纖維素分解菌/ Brown rot white rot
浸竹池 / Bacillus ; 嗜酸菌 : 冶金, 生物脫硫 b. 豆類,肉類加工廠: protease. Lipase ( Tween / Nile blue) 麵粉廠: amylase 花蜜. 蜂蜜. 蜜餞 : Yeast. (baker yeast) 柑橘. 草莓. 山芋: (Congo Red/ pectin)
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菌種的篩選 c. 局部極端環境: 回收機油(黑油): Yeast (Rhodotorula)
排油煙管. 溫泉: 耐熱菌 80 ~ 110℃, 不怕污染 高山凍土. 深海: 低溫菌(軸封)15℃. 培養for detergent. 深海:耐壓菌 (600 atm) Micrococcus 海參. 海鞘 : Bacteria toxin or antibiotic 深海魚腸 : 嗜壓古細菌: EPA, DHA 生產菌
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菌種的篩選 4. enrich : a. sole C or N source
(N2, 苯氨: cellulose, lignin. CO2, 有機酸,脂,烃 ) b. bait & trap : KCl, strach c. wet 80℃, 10 min for spore producer, dry air heating
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d. 10% phenol : inhibit mold & bacteria / for streptomyces.
bile salt : inhibit G(-) Bacteria. Penicillin. streptomycin, neomycin: Bacteria / Yeast. Mold. 放線菌酮: M.Y. Streptomyces 硫乙醇酸鈉: 嫌氣菌 e: serial dilution tubes : acid, antibiotics, bactericin, 大蒜汁, essential oil. 5.Agar flask filtrant/ Agar tube assay : medium C/N, c:source, N source. 6.Unculturable : Megagenome cloning
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菌種退化與複壯 自發性突變的結果 : 發生在細胞群體中，一個由量變到 質變的逐步演化過程. A. 表現型:
a. 細胞 or 菌落型態改變 e g. 畸形菌落,光禿不產孢 b. 生長速度變慢 c. 產量降低 d. 抗逆能力下降: 病源菌, 噬菌體,溫度等 B. Subculture越多代愈易退化,環境不佳愈易退化
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菌種退化與複壯 C. 複壯: a. 純菌落分離培養 b. 透過寄主體複壯 c. 利用環境篩除已衰退個體
d. 良好的保存方法: e g. 蒸餾水保存方法
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發酵培養 發酵培養: a. steps越少越好 b. seed 愈年輕越好 c. antifoam 事先探討
d. shear stress 判斷與降低 e. adaptive culture : e g. SO2 / wine, beer / 9℃ ,主發酵之趨近
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發酵培養 衰亡期之判斷: Ⅰ. 菌體活性低,胞內顆粒多,出現液泡,菌體膨大或不規 則(methylene blue)
Ⅱ. 自溶現象, 產孢現象. Ⅲ. 二次代謝物之產生. Ⅳ. 二次生長現象 : 2種 C or N. sources.
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A.菌種管理 保存與定期更新 長期保存方法開發及測試 菌種複核特性 科霍法則
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B.接菌管理 專用 laminar flow & UV殺菌 接菌技巧: 巴斯德鵝頸瓶試驗
E. coli : 70 %Ethanol : wash, not killing as soap
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C.三角瓶培養管理 澄清試驗: exclude bacteria & yeast plate test: exclude mold
active mycelium vs. inactive mycelium
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D.百升級管理 CIP 接菌槽設計 log phase~ early stationary phase
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E.噸級管理 (2-5T) CIP sparging hole plate assay microscope foaming
bioassay and chemical assay
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F. Downstream Boiling conc. : over night
F. Dry: over night / bag-packing milling into powder
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G.成品管理 Particle size moisture & hygroscopic 流動性 微生物檢測
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謝 謝 指 教
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