培养基、试剂的配制及 细菌纯化培养.

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1 培养基、试剂的配制及 细菌纯化培养

2 LB培养基 配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：
细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g NaCl　10g 摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。 不

3 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。

4 溶液 I back 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris·Cl (pH8.0)
10 mmol/L EDTA (pH8.0) 在10 lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。

5 溶液 II back 0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) 1% SDS

6 溶液 III back 5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。

7 3M乙酸钠(pH5.2） back 在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。

8 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 1 mol/L Tris·Cl (pH8.0)
在800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0 (约20g NaOH颗粒)，然后定容至1 L，分装后高压灭菌。 1 mol/L Tris·Cl (pH8.0) 在800ml 水中加入 121.1g Tris-base，溶解后加浓盐酸调节溶液的pH值至8.0 ，定容至1 L，分装后高压灭菌。

9 TE(pH8.0) back 10 mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0)

10 50×TAE 1×TAE 242g Tris 碱 57.1 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)
0.04 mol/L Tris-乙酸 0.001 mol/L EDTA (pH 8.0)

11 器材 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 离心机 4. 电泳仪和电泳槽 5. 玻璃器皿与耗材 量筒、三角瓶、平皿;
1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 离心机 4. 电泳仪和电泳槽 5. 玻璃器皿与耗材 量筒、三角瓶、平皿; EP管(1.5ml, 0.5ml); 枪头(1ml, 0.2ml, 10μl); 牛皮纸、纱布、牙签等

12 培养细菌： 将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时（过夜）;