DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。 1958年，遗传信息的单向.

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1 DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。 1958年，遗传信息的单向 中 心 法 则 劳氏肉瘤病毒的 遗传方式 致癌RNA病毒 复制 病毒（复制） 转录 DNA RNA 蛋白质 翻译 逆转录

2 Reverse transcription 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所 含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。

3 第一节 DNA的生物合成 一、DNA的半保留复制
定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制 半保留复制的实验证据:1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。

4 15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度

5 DNA的半保留复制的生物学意义： DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。 DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。

6 二、与DNA复制有关的酶和蛋白质 原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP)
模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA。 引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌 中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物。

7 催化因子 1.引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。 2.DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶，其催化反应的特点 （1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物；（2）反应需要有模板的指导；（3）反应需要有3-OH存在； （4）DNA链的合成方向为5   3  生物大分子合成： 底物、酶、 能量、模板 N 3 5  O OH PPP-O-CH2 OH P329需要模板的例证

8 （5） DNA聚合酶的反应可以利用DNA双链作为模板和引物，亦可以单链DNA作为模板和引物（P331图示）
（6）DNA的体外聚合必须加入少量的DNA才能进行。DNA在提取过程中易形成切口（nick）或缺口（gap）.则加入的DNA一条链作为模板而另一条链可作为引物。

9 原核生物中的DNA聚合酶 在大肠杆菌中发现有三种DNA聚合酶（用突变株研究其功能）： ⑴ DNA聚合酶Ⅰ:单体酶,多肽链内含一个锌原子（其鳌合剂是O-二氮杂菲），多功能酶。它具有5 3 聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）； 3’  5’外切酶活性（对双链无作用，校对功能。但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）及5’  3’外切酶活性（双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补）；在DNA链的3  形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。 ⑵ DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3’  5’外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。

10 ⑶ DNA聚合酶Ⅲ：是原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、、形成全酶的核心酶。具有5’3’DNA聚合酶活性（ 亚基，速率高）； 具有3’  5’外切酶（亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性；还具有5’  3’外切酶活性（单链有效，其意义未知）。 （4） DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。

11 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅱ DNA聚合酶Ⅲ
亚基数目 1（单体酶） ＞1（多亚基酶 ） ＞1（多亚基酶） 5’ 3’聚合活性 + 中 很低 很高 3‘ 5’外切活性 （保护DNA复制的 忠实性fidelity） 5‘ 3’外切活性 DNA 复制的主要 聚合酶，还具有3’-5‘ 外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性 主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。 修复紫外光引起的DNA损伤

12 在真核细胞内有五种DNA聚合酶 （与细菌DNA聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）
α β γ δ ε 定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核 3‘-5’ 外切 酶活性 功能 线粒体DNA 的复制 核DNA 的复制 修复 作用 引物 合成 修复 作用

13 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。
3 .DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。 3‘ 5‘ OH P

14 酶 + NAD+(ATP) 酶-AMP + 烟酰胺单核苷酸（PPi）
连接酶的反应机制： 酶 + NAD+(ATP) 酶-AMP + 烟酰胺单核苷酸（PPi） 酶-AMP + P-5‘-DNA 酶 + AMP-P-5’-DNA DNA-3’-OH + AMP-P-5’-DNA DNA-3’-O-P-5’-DNA+AMP DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用

15 拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。
4. 拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶 拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。 拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。 二者共同控制DNA的拓扑结构。 5、解螺旋酶 （解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。

16 rep蛋白沿3 ’5’移动，而解螺旋酶I、II、III沿5 ’ 3’移动。
6.其它蛋白因子： ⑴单链结合蛋白(SSB-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 ⑵引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’ 和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。 引发体可以沿模板链5’ 3’方向移动,具有识别合成起始 位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。 移动和引发均需要ATP提供能量， n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。

17 三、DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）
双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段

18 1、双链的解开 一些概念： DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori(或o）表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。 大肠杆菌染色体DNA以及真核生物的细胞器DNA为双链环状，只有一个复制原点，而真核生物染色体DNA是线性双链分子，含有许多复制起点。 从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。

19 复制原点由DnaA蛋白识别， 在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π 、 SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。 DNA复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growth point)，叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体（replisome） 复制叉

20 复制叉 起点 延伸 领头链 随后链 3’ 5’ DNA的双向复制

21 （2）RNA引物的合成 引发体在复制叉上移动，沿模板链5’ 3’的方向移动，与复制叉移动的方向相同，识别合成的起始位点， DnaB蛋白活化引物合成酶。引发RNA引物的合成。领头链先引发开始合成，以原来一条DNA单链为模板（3’  5’),按5’  3’的方向合成一段RNA引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。引物长度约为几个至10个核苷酸，在引物的5’端含3个磷酸残基（引物酶的底物是核苷三磷酸），3’端为游离的羟基。

22 （3）DNA链的延伸 领头链 随后链 冈崎片段 半不连续复制
在DNA聚合酶Ш的催化下，以四种脱氧核糖核苷5’-三磷酸为底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。两条链方向相反。 领头链 随后链 冈崎片段 半不连续复制 冈崎模型

23 领头链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。
随后链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链。 半不连续复制—在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。 发现（1968）： 同位素实验，3HdT 短时间内为DNA小片段一段时间后检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量DNA片段的积累。——证明DNA复制中有小片段合成。 测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。由于U替代dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。 在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。

24 冈崎片段 在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。 冈崎片段：真核生物中 个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中 个核苷酸（相当于一个顺反子）。

25 （4）切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段
（复制终止） 当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3’-OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。复制叉移动到终止区即停止复制（大肠杆菌有一个终止区）。这时会发生一系列变化：在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基；以修复方式填补终止区50-100bp的空缺。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链。结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。

26 四、真核生物中DNA的复制特点 1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2、冈崎片段长约200bp.
4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 5、真核生物有多种DNA聚合酶。 6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。

27 端粒结构 3 5  复制叉 终止区 端粒酶是含RNA的逆转录酶

28 大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制） 真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）
单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状） 3 D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）

29 六、逆转录 定义:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA称为逆转录，由逆转录酶催化进行。
1970年Temin和Baltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。 用特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素D专门抑制以DNA为模板的反应，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假说。

30 逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿5’3’方向合成DNA，并要求短链RNA作引物。
病毒RNA的逆转录过程 （以前病毒形式引起整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化） 单链病毒RNA RNA-DNA杂交分子 双链DNA（前病毒） 逆转录酶 + RNA+ DNA- DNA+ 逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿5’3’方向合成DNA，并要求短链RNA作引物。 逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交 分子中的RNA，可沿5’3’和3’ 5’两个方向起核 酸外切酶的作用。

31 cDNA：几乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。
逆转录酶发现的理论和实践意义： 不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。 1983年，发现人类免疫缺陷病毒（human immune deficience virus,HIV）,感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（ acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）

32 七、DNA的损伤修复 DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构。从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。 若DNA的损伤或错配得不到修复，会导致DNA突变。其主要形式： 一个或几个碱基被置换 插入一个或几个碱基 一个或多个碱基对缺失 DNA的损伤修复—— 四种修复途径:光复活、切除修复、复组修复和诱导修复（亦称暗修复）。

33 光复活：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上TT（CC CT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）
切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、 DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前） 重组修复 （发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。P349 诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS response）。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。

34 DNA的合成方式： DNA的复制：以DNA为模板 合成DNA。 逆转录：以RNA为模板合成DNA。 修复合成（DNA聚合酶I、 连接酶等）