telomere and telomerase

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1 telomere and telomerase
端粒与端粒酶 telomere and telomerase

2 端 粒（telomere） 是真核生物染色体末端的一种特殊结构 由端粒DNA和端粒蛋白质构成 作用：稳定染色体结构 防止染色体末端融合
保护染色体结构基因 避免遗传信息在复制过程中丢失

3 端粒的发现 1930年，著名的遗传学家 B.Mcclintock 和HJ.Müller发现：染色体的末端可维持染色体的稳定性；
Müller将它定义为“telomere”，这是由希腊语“末端”（telos）及“部分”（meros）组成的； 染色体失去了这些片段，就会互相粘连到一块，发生结构及功能上的改变，从而影响到细胞的分裂与生长。

4 端粒的发现 1970年，EH.Blackburn 利用四膜虫（Tetrahymena）揭示了端粒的初步结构：
由几个核苷酸组成的 DNA 重复片段，富含G （TTGGGG）n，重复的次数由几十到数千不等。

5 分裂中期染色体结构 —— 端粒 端粒下区subtelomeric region与端粒DNA相邻，由一些退化的端粒DNA片断的重复组成

6 端粒DNA序列 人的端粒DNA序列 长约5～15kb 序列：（TTAGGG）n ，串联重复

7 不同生物端粒DNA长度 酵母 — 400 bp 尖毛虫 20 bp 小鼠 — 80 kb 大鼠 kb

8 端粒酶的发现 1972年，JD.Watson发现： DNA 聚合酶不能够完整地复制线性染色质；
如果这一间隙不能够被填充，染色体DNA将失去这一DNA片断； 每经过一次复制、分裂，染色体就将丢失一部分的端粒结构，影响到与端粒相邻的一些重要基因； 科学家们考虑：可能存在着一种不同于DNA 聚合酶的酶来完成单链间隙的复制。

9 示意图

10 端粒酶的发现 1984，CW.Greider和EH.Blackburn发现：将一段单链的末端寡聚核苷酸加至四膜虫的提取物中后，端粒的长度延长了，这就说明了切实有这样的一种酶存在； 将它命名为：“端粒酶”（telomerase）； 进一步的研究揭示了端粒与端粒酶在细胞的生长及肿瘤发生中有非常重要的意义，现正成为一个研究的热点。

11 端粒酶 一种核糖蛋白酶，有三个主要组成部分 人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）
端粒酶相关蛋白（telomerase-associated protein，TP1/TLP1） 人端粒酶催化蛋白亚单位（the catalytic protein subunit of telomerase，hTERT）

12 端粒酶的结构

13 端粒酶 是端粒复制所必须的一种特殊的DNA聚合酶； 具有逆转录酶活性； 能以hTR为模板，向染色体末端添加TTAGGG序列。

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15 端粒酶的爬行模型（动画演示）

16 端粒酶作用模式

17 端粒酶作用模式

18 端粒酶延伸端粒的机制

19 端粒酶 在大多数的正常人的体细胞中没有活性 近年来的研究发现： 提示： 衰老者端粒缩短；
大约在85%-95%的肿瘤细胞中检测到了端粒酶活性（端粒酶阳性）。 提示： 端粒、端粒酶与癌症之间存在相关性？？？ 端粒、端粒酶与衰老之间存在相关性？？？ 端粒酶激活可能是细胞癌变（或永生化）的一个共同通路。

20 端粒与衰老 1973年， Olovnikov博士，首次提出： ——端粒丢失同衰老有关。
端粒的丢失很可能是因为某种与端粒相关的基因发生了致死性的缺失。

21 目前结论： 细胞内端粒酶活性的缺失，导致：端粒缩短。
端粒一旦缩短到短于某个 “关键长度” ，就很有可能导致：染色体双链断裂，并激活细胞自身的检验系统，使细胞进入M1期死亡状态。 随着端粒的进一步丢失，发生染色体重排，导致：无着丝粒染色体和非整倍体染色体的形成等，使细胞进入M2期死亡状态。 非整倍体染色体：染色体数目不是该物种单倍体数目的倍数

22 目前结论（续）： 如果细胞要维持其正常分裂，就必须激活端粒酶，阻止端粒的进一步丢失； 否则，细胞不能进行染色体的正常复制；
只有重新获得端粒酶活性的细胞，才能继续生存下去； 无法激活端粒酶的细胞（即无法阻止端粒进一步丢失），只能面临趋向衰老。

23 端粒丢失与衰老关系 端粒丢失是衰老的原因？还是结果？
目前的研究结果还处在探索阶段，各种关于端粒/端粒酶参与细胞增殖与转化的证据大多比较粗浅，而且，尚未被证实。

24 端粒、端粒酶与癌症 研究染色体在肿瘤形成中的变化，发现： 统计资料表明： 提示：端粒酶活性的变化与细胞恶化有关。
端粒、端粒酶与癌症　 研究染色体在肿瘤形成中的变化，发现： 人恶性肿瘤细胞：均呈现端粒酶活性； 正常体细胞：检测不到端粒酶活性； 统计资料表明： 84.8%的恶性肿瘤具有活化状态的端粒酶； 仅在4.2%的正常组织、癌旁组织和良性肿瘤中端粒酶呈阳性； 提示：端粒酶活性的变化与细胞恶化有关。 1 人类试图用端粒/端粒酶理论解决对抗癌症问题 2 众所周知，肿瘤是一种体细胞遗传病，因此人们很早以前就把目光集中到遗传物质的载体——染色体上。

25 端粒酶活性升高可能引起癌症 对癌细胞的研究发现： 癌细胞通过分泌大量端粒酶来防止染色体端粒缩短，以便不断分裂繁殖。
永生化是癌细胞所具有的显著行为； 端粒酶被激活的细胞也具有永生化行为； 癌细胞具有端粒酶被激活的细胞所具备的特性； 抑制端粒酶活性，使永生化细胞转变为正常细胞。 癌细胞通过分泌大量端粒酶来防止染色体端粒缩短，以便不断分裂繁殖。

26 端粒酶缺乏同样会引起癌症 美国哈佛医学院的科学家：对实验鼠进行了基因改造，使其体内缺乏端粒酶以及一些抗癌蛋白质（p53），结果发现，实验鼠患上了鼠类通常不会患的人类癌症——器官上皮细胞癌。 研究表明：端粒酶缺乏同样会引起癌症。

27 Hiyama等人（1995），研究了100例成纤维神经细胞瘤，发现：
有端粒酶活性表达的肿瘤组织占94%； 端粒酶活性越高的组织越容易伴有其它遗传学变化，并且预后不良； 低端粒酶活性的肿瘤组织中未见有相应的变化，且都预后良好； 甚至有3例处于IVS阶段的无端粒酶活性的病例竟出现了肿瘤消退的现象； 这似乎说明：端粒酶同癌症之间存在着相关性，但是否是因果关系，还很难定论。

28 衰老端粒/端粒酶 癌症 衰老可能是由端粒的缩短所致，激活端粒酶似乎可以阻止衰老。
可是，端粒酶一旦被重新激活，细胞又将成为永生化细胞，继而衍变为癌细胞。 如何能恰当、正确的发挥端粒/端粒酶在解决衰老与癌症中的作用？ 生命科学领域一个极具挑战性的课题。 为了避免衰老而导致癌症，这显然不是人们激活端粒酶的初衷。

29 端粒抑制剂的研究 Colorado大学的Thomas Cech 和Robert Weinbrg博士：
已克隆出一种控制人类细胞端粒酶活性的基因； 应用这种基因，很有可能得到一种新的蛋白质—端粒酶控制剂； 目前，端粒酶控制剂直接用于人体试验还尚不成熟，但为人类征服癌症以及其它的同衰老有关疾病的治疗指了方向。

30 抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤治疗研究 主要策略有：
抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤治疗研究 主要策略有： ① 阻断端粒酶RNA的模板作用 ② 抑制端粒酶催化蛋白亚基 ③ 核苷类似物竞争性抑制反转录过程 ④ 细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性 ⑤ 对细胞内调节机制进行调控 ⑥ 其它抑制剂对端粒酶活性的调节

31 抑制端粒酶活性 ——阻断端粒酶RNA的模板作用
端粒酶是以其自身RNA为模板来合成端粒DNA序列，因此可以通过消除其模板作用抑制端粒酶活性，达到限制端粒合成的目的。 消除端粒自身模板作用的方法： 反义核苷酸封闭hTR 反义肽核酸封闭hTR 锤头状核酶切割hTR序列

32 反义核苷酸封闭hTR　　 端粒酶 RNA序列中含有与端粒DNA互补的模板序列，因此可设计能与之结合的反义核苷酸来灭活端粒酶，从而阻止端粒序列的合成； Feng等首先用含反义hTR的质粒转染HeLa细胞,经过23～26倍增时间后，HeLa 细胞进入生长危机，并伴随端粒长度的缩短和端粒酶活性的抑制。

33 反义核苷酸封闭hTR 为了提高抗反义核酸降解和进入组织细胞的能力， Piytts 等设计了一种甲基化的反义 RNA（ 2’-O-methyl-RNA ），用阳性脂质将其导入人前列腺肿瘤细胞系DU145，使细胞的端粒酶活性减少了97%； 有学者发现，用硫代反义核苷酸活性，还能抑制淋巴瘤细胞系OMABL1的生长，诱导细胞凋亡。

34 反义肽核酸封闭hTR 肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一类人工合成的DNA或RNA类似分子；
PNA具有与天然DNA相类似的结构特征和相同的DNA/RNA结合特性。

35 PNA与DNA结构比较 骨架由 N-（ 2-氨基乙基）甘氨酸构成 碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸氨基连接
碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨基连接

36 PNA对DNA或RNA的亲和力较相应DNA与DNA 和 DNA与RNA之间的亲和力高
在100mmol/L NaCl 溶液中，每碱基的Tm值约升高5℃； 导致PNA-DNA双链和PNA-RNA双链的Tm值升高的原因是由于 PNA-DNA和 PNA-RNA 中两条单链之间缺乏静电排斥力； PNA-DNA 和PNA-RNA双链的方向可以是同向平衡，也可以是反向平衡，反向平衡时Tm值更高。

37 不同盐浓度对杂交分子Tm值的影响 NaCl浓度 PNA/DNA DNA/DNA 0 mmol/L 72℃ 38℃ 140 mmol/L 69℃ 56℃ 1000 mmol/L 65℃ 65℃

38 反义肽核酸封闭hTR PNA不带电荷，中性骨架间无排斥力，使之具有比DNA寡核苷酸更强的结合力和抗蛋白酶和核酸酶降解能力；
Norton等，设计了针对hTR模板区的不同长度的PNA，发现其对端粒酶活性的抑制在一定长度范围内随链的延长而增强； PNA的高度亲和性、高度特异性和抗降解能力，使之成为极具潜力的抗肿瘤新药。

39 锤头状核酶切割hTR序列 核酶是一类具有酶活性的小分子RNA，通过序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，从而使其失去生物学功能；
Wan等，合成了一种甲基化修饰的锤头状核酶（2’-O-methyl-modified hammerhead ribozymes），具特异性切割hTR模板区序列的功能。

40 核酶：四膜虫 rRNA自我剪切

41 锤头状核酶切割hTR序列 将该酶与人神经胶质瘤U87-MG 细胞系的细胞抽提物共同孵育，端粒酶活性受到明显抑制，这种抑制作用具有剂量依赖效应； Yokoyama等，设计了针对人端粒酶RNA模板区的锤头状核酶，能有效切割非细胞体系中的RNA底物，将其导入子宫内膜癌细胞后，可明显抑制端粒酶活性。 上述研究表明：这可能是一条有效的治疗肿瘤的新途径

42 抑制端粒酶活性 ——抑制端粒酶催化蛋白亚单位
Horikawa等发现：将正常人3号染色体导入人肾癌细胞系RCC23，可引起其端粒酶活性的抑制、端粒的进行性缩短和细胞的老化，并且证实端粒酶活性的抑制是由于编码hTERT的基因的下调引起的，提示：3号染色体上存在直接或间接控制hTERT基因表达的基因； 最近大量研究表明：端粒酶三个主要组成成分中 hTERT与肿瘤的关系最密切，已成功将其克隆； hTERT有望成为肿瘤基因治疗的新的理想靶点。

43 抑制端粒酶活性 ——核苷类似物竞争性抑制反转录
抑制端粒酶活性 ——核苷类似物竞争性抑制反转录　 端粒酶具有反转录酶活性，在催化合成端粒DNA的过程中，需要有4种 dNTP的参与； 利用核苷类似物竞争性抑制反转录过程抑制端粒酶活性阻止端粒延长。

44 抑制端粒酶活性 ——核苷类似物竞争性抑制反转录
Strahl等发现：双脱氧鸟嘌呤核苷（dideoxyguanosine，ddG）可使永生化的人淋巴细胞株 JY616 和 Jurkat E6-1的端粒发生进行性缩短和端粒酶活性的明显抑制，而且ddGTP也有类似的抑制作用。

45 抑制端粒酶活性 ——核苷类似物竞争性抑制反转录
Melana等在培养基中加入叠氮脱氧胸苷（3’-azido-3‘-deoxythymidine，AZT），发现： 乳腺癌细胞系（四种） T4白血病细胞 出现生长抑制和端粒酶活性的抑制，但不同细胞系所需剂量不同。

46 抑制端粒酶活性 ——细胞分化诱导剂　 分化不良的恶性肿瘤细胞端粒酶活性一般很高，但终末分化的正常人体细胞却无端粒酶活性表达，这提示：细胞分化与端粒酶活性之间存在某种关系； Bestilny，等：研究发现，维甲酸（RA）、二甲亚砜（DMSO）和TPA（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）在诱导 HL60白血病细胞等永生化细胞终末分化时，可明显抑制细胞端粒酶活性，并使凋亡细胞增多。但这些诱导剂本身并不能直接抑制端粒酶活性，提示：端粒酶活性的下调是细胞分化所造成的。

47 抑制端粒酶活性 ——细胞分化诱导剂 Sharma，等：将DMSO作用于Brukitt淋巴瘤 Raji 细胞系，发现其产生可逆性G0/G1停滞，并有端粒酶活性的抑制； 杨骅，等：分别用维甲酸和苦参碱间接抑制了大肠癌细胞和红白血病细胞株K562的端粒酶活性，这种抑制作用的机制目前尚不清楚。

48 抑制端粒酶活性 —对细胞内调节机制进行调控
抑制端粒酶活性 —对细胞内调节机制进行调控　 目前的研究表明：端粒酶活性受多种细胞内机制的调节，故对这些调节机制进行调控也能有效地抑制端粒酶活性； Fujimoto，等：将与c-myc mRNA互补的反义寡核苷酸作用于三种人白血病细胞系HL60、U937和K562细胞，发现：三种细胞的端粒酶活性都有明显下调。

49 抑制端粒酶活性 —对细胞内调节机制进行调控
抑制端粒酶活性 —对细胞内调节机制进行调控 Mandal，等：发现：在 IL-2依赖的细胞毒T细胞系CTLL-2细胞中，下调凋亡相关基因Bcl-2的表达可引起端粒酶活性的抑制，而Bcl-2的过度表达则可引起肿瘤细胞端粒酶活性的明显升高。

50 抑制端粒酶活性 ——其它抑制剂对端粒酶活性的调节
端粒酶活性也受其它一些抑制剂的调节 如蛋白激酶抑制剂和DNA交联剂 Stao，等：发现：高浓度生物碱9-HE（9-hydroxyellipticine，一种蛋白激酶抑制剂），可快速、完全地抑制端粒酶活性； 提示：端粒酶蛋白亚基的磷酸化及去磷酸化可能参与端粒酶活性的调节。

51 抑制端粒酶活性 —其它抑制剂对端粒酶活性的调节
最近，Li，等：证实：人端粒酶蛋白组分hTP1 和hTERT都是磷酸蛋白，其磷酸化是人乳腺癌细胞端粒酶活化的必要条件； Kang，等：证实：hTERT是激酶 Akt的底物蛋白， hTERT 肽链的磷酸化可引起端粒酶活性的上调。

52 抑制端粒酶活性 ——其它抑制剂对端粒酶活性的调节
以上研究表明：蛋白激酶抑制剂可有效阻断端粒酶蛋白的磷酸化，从而抑制端粒酶活性； Burger，等：发现：DNA 交联剂cisplatin（顺铂）可抑制人睾丸癌细胞端粒酶活性，且这种抑制作用具有浓度依赖性； Ishibashi，研究也得到类似结果，并发现：较高剂量的顺铂对端粒酶活性的抑制可能是由于TTAGG重复序列的交联，也可能是顺铂作用于酶蛋白成分所必须的巯基基团。

53 总结 以端粒酶为靶点的肿瘤治疗研究已取得了一系列可喜的成果；
反义核苷酸、肽核酸、核酶、细胞分化诱导剂等作为端粒酶抑制剂正显示出良好的应用前景，而且这方面的研究还在不断深入； 端粒酶抑制剂要作为一种肿瘤治疗药物应用于临床，还有许多问题需要解决。 第一，端粒酶活性调节的确切机制还不清楚，不同的抑制剂对同一种细胞或同一种抑制剂对不同的细胞的抑制作用都不相同，如何针对不同的肿瘤选择最有效的抑制剂，还需要进一步研究。 第二，除恶性肿瘤细胞有端粒酶活性的表达外，正常人类生殖细胞、造血干细胞、外周血白细胞、表皮细胞等具有再生能力的细胞也有不同水平的端粒酶活性表达，所以端粒酶抑制剂的毒性评价也是一个非常重要的问题[25]。 第三，迄今为止绝大多数的抗端粒酶研究都是在体外进行的，如何建立合适的动物模型还有待研究。 第四，从端粒酶活性的抑制到肿瘤细胞的凋亡有一个过程，这期间肿瘤可以持续生长，对机体产生致命伤害，因此如何缩短这一过程提高疗效也是至关重要的。

54 展望 虽然，以端粒酶为靶点的肿瘤治疗的研究刚刚起步，但已显示出了很强的潜在应用价值；
相信随着研究的不断深入，对端酶活性的抑制必将成为一种有效的肿瘤治疗手段，为人类最终战胜肿瘤发挥作用。

55 肿瘤发生的端粒-端粒酶学说 随着有丝分裂次数的增加，端粒逐渐缩短，当其缩短到一定程度，细胞停止分裂进入永生化Ⅰ期，即M1期。此期大部分细胞在p53基因调控下将衰老死亡，仅有少部分细胞通过病毒癌基因的整合或p53、Rb等抑癌基因的突变使细胞逃脱死亡，再继续分裂50左右，端粒长度缩短到危机点，细胞进入永生化Ⅱ期，即M2期。绝大部分细胞因为端粒极度缩短不能维持其功能而死亡，仅有少部分细胞通过某种机制激活端粒酶，使端粒长度得以维持，因而成为永生化细胞。

56 端粒酶活性与胃癌 检测66例胃癌及残端标本的端粒酶活性， 结果： 结论：在胃癌中端粒酶活性升高。
Hiyama K,Hiarai YK,Kyoizumi SS,et al. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cell. J Immunol 1995,155:3711. 检测66例胃癌及残端标本的端粒酶活性， 结果： 早期胃癌的阳性率82.3% (14/17) 中晚期阳性率为85.7% (42/49) 残端阳性率为6.1% (4/66) 结论：在胃癌中端粒酶活性升高。

57 端粒酶活性与胃癌 结论：端粒酶活性升高在胃癌中是一种普遍现象。认为端粒酶可以作为胃肠道肿瘤诊断的有力标志物。
贾汝梅，张玉印，宋伟庆，等。胃癌与端粒酶活性表达及DNA倍体关系的研究。中国胃肠外科杂志2000年第3卷第2期 结果： 胃癌端粒酶阳性率为83.3% (25/30) 非瘤残端阳性率为3.3% (1/30) 结论：端粒酶活性升高在胃癌中是一种普遍现象。认为端粒酶可以作为胃肠道肿瘤诊断的有力标志物。

58 残端组织端粒酶阳性的原因： (1) 残端组织重度炎症，大量淋巴细胞浸润，而淋巴细胞有微弱的端粒酶活性，所以炎症反应极重的组织端粒酶可能会呈弱阳性； (2) 残端组织含微转移灶所致，病理仅能通过光镜检测1个平面有无癌转移，端粒酶检测则是测定立体团块细胞的酶活性，比光镜更全面，更易发现肿瘤微转移灶； (3) 癌前病变也可导致端粒酶阳性表达 。

59 作业一： 端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗的研究新进展