细胞工程学实验内容 ★ 实验一 植物细胞培养基的种类及配制 ★ 实验二 植物愈伤组织的诱导 ★ 实验三 植物愈伤组织细胞的培养.

Presentation on theme: "细胞工程学实验内容 ★ 实验一 植物细胞培养基的种类及配制 ★ 实验二 植物愈伤组织的诱导 ★ 实验三 植物愈伤组织细胞的培养."— Presentation transcript:

1 细胞工程学实验内容 ★ 实验一 植物细胞培养基的种类及配制 ★ 实验二 植物愈伤组织的诱导 ★ 实验三 植物愈伤组织细胞的培养

2 实验一 植物细胞培养基的种类及配制 二、实验材料 一、实验目的 1、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。 2、掌握MS培养基的配制方法。
实验一 植物细胞培养基的种类及配制 一、实验目的 1、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。 2、掌握MS培养基的配制方法。 二、实验材料 1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净 工作台。 2、实验器材：电磁炉、烧杯、量筒、搅拌棒、吸量管、 移样枪。

3 三、植物细胞培养基的种类 在100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中，研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方，但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演变而来的，其中应用最为广泛的仍为MS培养基。植物组织培养基早期的建立，如White提出的根培养基和Gautheret提出的愈伤组织培养基，都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而来的。以后所有的各种培养基又都是在White培养基和Gautheret培养基的基础上形成的。各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。常用培养基中根据无机盐的含量可以分为4类，分述于下：

4 1、高无机盐含量培养基：高无机盐含量培养基中，钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS培养基和ER培养基。
2、较高硝酸钾含量培养基：较高硝酸钾含量培养基适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5培养基和N6培养基。

5 3、中等无机盐含量培养基：中等无机盐含量培养基中，大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，适合于花药培养。主要有Nitsch培养基和NT培养基。
4、低无机盐含量培养基：低无机盐量培养基中，大量元素含量大幅降低而且种类减少，多数用于生根培养基。主要有White培养基和Heller培养基。 各种植物培养基的营养组成及配方如下表：

6 培养基（mg/L） 培养基成分 MS （1962） ER（1965） B5 （1968） N6 （1975） Nitsch 1963 NT
（1971） White（1963） Heller （1953） NH4NO3 KNO3 CaCl2·2H2O CaCl2 MgSO4·7H2O 1 650 1 900 440 370 1 200 150 250 2 830 166 185 720 950 825 220 1 233 80 750 75 KH2PO4 （NH4）2SO4 Ca（NO3）2·4H2O NaNO3 Na2SO4 170 340 134 400 463 68 680 300 200 600 NaH2PO4·H2O KCl KI H3BO3 MnSO4·4H2O 0.83 6.20 22.30 0.63 2.23 0.75 3.00 0.80 1.60 4.40 10.00 25.00 19.00 65.00 1.50 5.00 125 0.01 1.00 0.10 MnSO4·H2O ZnSO4·7H2O ZnSO4·4H2O Zn·Na2·EDTA Na2MoO4·2H2O 8.60 0.25 15.00 0.025 2.00 3.80 MoO3 CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O CoSO4·7H2O AlCl3 0.0025 0.03 0.001 0 .01 NiCl2·6H2O FeCl3·6H2O Fe2（SO4）3 FeSO4·7H2O Na2·EDTA·2H2O 27.80 37.30 2.50 肌醇 烟酸 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 甘氨酸 100 0.50 0.05 叶酸 生物素 蔗糖 D-甘露醇 30 000 40 000 20 000 50 000 10 000

7 四、MS培养基的配制 植物细胞培养基种类很多，如MS、ER、B5、N6、NT和White等。本实验以MS完全培养基为例，介绍植物细胞培养基的配制方法。 （一）MS培养基母液的配制 母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。大量元素一般配制成10倍浓度的母液，微量元素和有机物常配制成100倍浓度的母液。见下表。

8 母 液 成 分 规定量（mg/L） 扩大倍数 称取量（mg） 母液体积（mL） 配1L培养基吸取量（mL） 编号 种类 1 大 量 元 素 KNO3 1 900 10 19 000 1000 100 NH4NO3 1 650 16 500 MgSO4·7H2O 370 3 700 KH2PO4 170 1 700 2 钙盐 CaCl2·2H2O 440 4 400 3 微 MnSO4·4H2O 22.3 2 230 ZnSO4·7H2O 8.60 860 H3BO3 6.20 620 KI 0.83 83 Na2Mo4·2H2O 0.25 25 CuSO4·5H2O 0.025 2.5 CoCl2·6H2O 4 铁 盐 Na2·EDTA 37.30 3 730 FeSO4·4H2O 27.80 2 780 5 有 机 物 质 甘氨酸 2.00 50 500 盐酸硫胺素 0.10 盐酸吡哆醇 0.50 烟酸 肌醇 5 000

9 上表提供了MS培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大倍数准确称量、分别溶解后，按先后次序加入蒸馏水中，最后用蒸馏水定容。
注意：在混合定容时，一定要掌握药剂的先后次序或稀释度，以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应，因此需单独配制。铁盐为螯合状态时，有利于植物在适宜的pH下吸收和利用，因此需与螯合剂Na2·EDTA混合配制。生长调节类物质一般分别配制成0.2~1.0mg/L的母液，用时按量吸取。某些生长调节剂不溶于水，需用不同溶剂进行溶解，如NAA、2,4-D、IAA、IBA、GA3是醇溶性的，配制时先用少量95%酒精溶解，然后再用蒸馏水定溶；KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量1mol/L盐酸中，然后再用蒸馏水定容；叶酸先用少量稀氨水溶解后再定容。 配制好的各种母液倒入棕色瓶中，贴好标签，保存于4℃冰箱中备用。注意：母液保存于冰箱中的时间不宜过长，一般为1~2个月，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能再使用。

10 （二）MS完全培养基的配制 以配制1 000mL MS完全培养基为例，配制全过程如下： 1、在洁净的不锈钢（或搪瓷）容器中加入1/2终体积
2、按上表内容规定的量，精确吸取各种母液，依次加入到 盛有1/2终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中，记录 此时的总体积。注意：母液不能混合后加入，也不能同 时加入，必须依次缓慢加入，且要一边加入一边搅拌， 以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应； 3、根据培养目的及要求，加入所需量的各种生长调节物 质，记录此时的总体积（如用于长春花叶愈伤组织的诱 导：加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、 KT 0.2mg/L）；

11 4、加入30g蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，
PVP，抗氧化剂，防止或减轻植物组织褐化，也可用一定 量的维生素C、活性碳代替，或不加，视情况而定），充 分混匀后，补充蒸馏水至终体积1 000mL，然后用1mol/L 盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基至pH5.8； 5、精确称取15g琼脂加入其中，在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此 过程需加以搅拌，防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出； 6、琼脂溶解后，及时将培养基分装于150mL三角瓶中，约 50mL/瓶，包膜密封，并于100KPa、121℃下灭菌15~20分 钟。冷却备用。

12 注意：培养基的pH直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固，pH低于5
注意：培养基的pH直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固，pH低于5.5时，琼脂凝固程度不好，pH高于6.0时，琼脂过度凝固，培养基变硬，不利于培养材料对营养物质的吸收及对代谢废物的排放，从而影响培养材料的生长。培养基的pH可用酸度计测试，并用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调整至适宜范围（1mol/L盐酸配制方法：取12mol/L HCl 84mL，加入蒸馏水定容至1 000mL；1mol/L氢氧化钠配制方法：称40g NaOH，溶解后加入蒸馏水，定容至1 000 mL）。培养的植物材料其生长最适pH范围为5.6~6.0，培养基经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加，pH一般可降低0.2，因此配制植物培养基时，通常调整pH至5.8。

13 对于某些不能高压高温灭菌的试剂或药品，必须过滤除菌，待培养基灭菌后未凝固之前（45~60℃）加入，并轻摇使混匀。这时，每个培养容器的装入量和过滤除菌后的物质都要事先计算好，定量加入其中。植物培养基的配制程序可用流程图表示如下： 水 药品 混匀 pH调整 琼脂 加热溶解 糖 玻璃器皿 水洗 干燥 分装 密封 接种 冷却 高温蒸汽灭菌

14 实验二 长春花叶片愈伤组织的诱导 一、实验目的 二、实验原理
实验二 长春花叶片愈伤组织的诱导 一、实验目的 通过对长春花叶片愈伤组织的诱导，分析生长素和细胞分裂素对长春花叶片离体培养的作用，熟练掌握植物组织离体培养培的基本操作技术，了解植物组织在离体培养条件下脱分化的条件及特点。 二、实验原理 根据植物细胞全能性理论，利用MS培养基，加入一定浓度的生长素和细胞分裂素对长春花叶片组织进行培养，在光照或黑暗条件下均可诱导长春花叶片组织发生脱分化而产生愈伤组织，这已经在许多植物的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物（如葫芦藓）中也得到了证实。

15 三、实验材料 1、实验设备：超净工作台、高压灭菌锅、pH计、光照培养 2、实验器材：三角瓶（150 mL）、棕色瓶（100 mL， 500
箱、暗培养箱。 2、实验器材：三角瓶（150 mL）、棕色瓶（100 mL， 500 mL，1000 mL）、长柄镊子、塑料烧杯（500 mL，l000 mL）、玻璃烧杯（100 mL、500 mL，l000 mL）、量筒（100 mL，500mL， 1000 mL）、培养皿（∮=12 cm）、手术刀。 3、实验试剂：萘乙酸（Napthylacetic acid，NAA）、6-苄基 氨基嘌呤（6-Benzylamino purine，6-BA）、 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4- Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、KT （kinetin，KT）、升汞（HgCl）、次 氯酸钠 溶液、95%酒精、蔗糖（Sucrose）、琼脂 （Agar）、MS基本培养基母液。

16 4、试剂配制： （1）MS基本培养基母液：见实验一MS培养基配方表。 （2）1 mol/L NaOH：将40g NaOH溶解在1升蒸馏水中， 搅拌均匀。 （3）1 mol/L HCl：用蒸馏水将12mol/L的浓盐酸稀释12 倍。 （4）生长调节剂母液： ① 0.2 mg/mL萘乙酸（NAA）溶液：精确称取20mg 萘乙酸，用少量1 mol/L NaOH溶解后，用蒸馏水 稀释并定容到100 ml。 ② 0.2 mg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液：精 确称取20 mg 2,4-二氯苯氧乙酸，用少量1 mol/L 的NaOH溶解后，用蒸馏水稀释并定容到100ml。

17 ③ 0.2 mg/mL 6-苄氨基嘌呤（6-BA）溶液：精确称取20
mg 6-苄基氨基嘌呤，用少量1 mol/L的HCl溶解后， 用水稀释并定容到100ml。 ④ 0.1 mg/mL KT（kinetin，KT）溶液：精确称取10 mg KT，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用水稀释并定容 到100ml。 （5）75％的消毒酒精：精确量取75ml无水乙醇溶于100ml 蒸馏水中。 （6）0.1%升汞（HgCl）溶液：精确称取1 g HgCl，用蒸馏 水溶解并定容到1 000ml，盛装于棕色试剂瓶中避光保 存。 （7）10%次氯酸钠溶液：精确量取100ml次氯酸钠溶液 溶，用蒸馏水溶解并定容到1 000ml，盛装于棕色试剂 瓶中避光保存。 5、实验用植株：长春花幼苗。

18 四、实验步骤 1、MS完全培养基的配制： （1）将各种贮液按比例混合，配制成MS培养基（具体操 作见实验一）；
（2）分别加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、KT 0.2mg/L（此激素配方只适用于长春 花叶片愈伤组织的诱导。对于不同植物的外植体来 说，影响其脱分化的激素种类和用量是不一样的， 必需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）；

19 （3）培养基中加入3％蔗糖，完全溶解后加蒸馏水至终体
积； （4）用l N的NaOH调整培养基至pH 5.8； （5）加入15g/L琼脂，将培养基置电磁炉上煮沸至琼脂完全 溶解，然后分装到150ml三角瓶中，每瓶约70 ml，用 封口膜包扎瓶口； （6）将三角瓶放入高压灭菌锅，于121℃、100KPa下灭菌 15~20 min。待压力下降为零，温度降低到105℃以 下，打开放气阀排气后，取出三角瓶，平放冷却备用； （7）按上述方法高压灭菌蒸馏水、空三角瓶、培养皿（带 滤纸）及其它相关用具。

20 2、外植体的表面消毒与接种培养： （1）取长春花完全展开的幼叶，用自来水流水冲洗1~2 h； （2）在超净工作台上用无菌水将叶片洗涤2~3次，每次1 min，然后浸于含75％酒精的无菌三角瓶中轻摇30s， 再移入0.1％升汞溶液中轻摇5~8 min或10％的次氯酸钠 溶液中轻摇8~10 min（消除外植体表面的微生物）， 无菌水洗涤3~5次（消毒液对外植体有很大伤害，必须 清洗干净），每次3 min；

21 （3）将消毒后的长春花叶片置于无菌培养皿内（有无菌滤
纸），用手术刀将无菌叶片切成5mm×5 mm大小； （4）将适宜大小的外植体接种到培养基上，每个三角瓶中接 入3~4块叶外植体； （5）将接种好的三角瓶置于光培养箱（光周期为：光照16 h 和黑暗8 h，光照强度约l500 lx左右）或暗培养箱内的培 养架上，培养温度为26±1℃； （6）每天观察培养情况，记录结果。如：接种培养后，外植 体（培养材料）在形态学上的变化情况，愈伤组织开始 出现时间、愈伤组织诱导率、形态、生长速率、颜色变 化及质地等指标。预期结果见图2-1。

22 【思考题】 1、影响长春花叶外植体脱分化的条件及特点是什 么？ 2、对于同一物种的不同组织来说，其愈伤组织诱 导条件是否一样？为什么？

23 实验八 植物愈伤组织细胞的传代培养 一、实验目的 二、实验原理 1、 掌握植物愈伤组织细胞传代培养的原理及操作方法。
实验八 植物愈伤组织细胞的传代培养 一、实验目的 1、  掌握植物愈伤组织细胞传代培养的原理及操作方法。 2、 了解植物细胞培养的意义。 二、实验原理 和动物细胞传代培养一样，植物细胞传代培养也是组织培养的常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中培养时，细胞不断生长增殖，培养基中的营养成分逐渐耗尽，同时也积累大量的代谢废物，从而反馈抑制细胞的生长，甚至导致细胞褐化而死。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足，营养障碍，生长条件恶化而死亡。细胞由原培养瓶内分离后转到新的培养瓶中继续培养的过程称为传代培养。传代培养可获得大量细胞供实验或生产所需。

24 三、实验材料 1、实验设备：超净工作台、pH计、高压灭菌锅、生化培 养养箱。 2、实验器材：三角瓶（150 mL）、棕色瓶（100 mL，
杯（500 mL，l000 mL）、玻璃烧杯（100 mL、500 mL，l000 mL）、量筒（100 mL，500 mL，1000 mL）、培养皿 （∮=12 cm）、手术刀。 3、实验试剂：萘乙酸（Napthylacetic acid，NAA）、6- 苄基氨基嘌呤（6-Benzylamino purine，6- BA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4- Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、 KT（kinetin，KT）、95%酒精、蔗糖 （Sucrose）、琼脂（Agar）、MS基本培 养基母液。

25 4、生长调节剂母液： ① 0.2 mg/mL萘乙酸（NAA）溶液：精确称取20mg萘乙 酸，用少量1 mol/L NaOH溶解后，用蒸馏水稀释并定 容到100 ml。 ② 0.2 mg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液：精确称取 20 mg 2,4-二氯苯氧乙酸，用少量1 mol/L的NaOH溶解 后，用蒸馏水稀释并定容到100ml。 ③ 0.2 mg/mL 6-苄氨基嘌呤（6-BA）溶液：精确称取20 mg 6-苄基氨基嘌呤，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用 水稀释并定容到100ml。 ④ 0.1 mg/mL KT（kinetin，KT）溶液：精确称取10 mg KT，用少量1 mol/L的HCl溶解后，用水稀释并定容到 100ml。

26 5、75％的消毒酒精：精确量取75ml无水乙醇溶于100ml蒸
馏水中。 6、实验材料：长春花叶片愈伤组织细胞。

27 四、实验步骤 1、MS完全培养基的配制： （1）将各种贮液按比例混合，配制成MS培养基（具体操 作见实验一）；
（2）分别加入2,4-D 0.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 0.5mg/L、KT 0.3mg/L（此激素配方只适用于长春花 叶片愈伤组织细胞的生长。对于不同的愈伤组织细胞 来说，影响其生长的激素种类和用量是不一样的，必 需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）；

28 （3）培养基中加入3％蔗糖，完全溶解后加蒸馏水至终体
积； （4）用l N的NaOH调整培养基至pH 5.8； （5）加入15g/L琼脂，将培养基置电磁炉上煮沸至琼脂完全溶 解，然后分装到150ml三角瓶中，每瓶约50 ml，用封口 膜包扎瓶口； （6）将三角瓶放入高压灭菌锅，于121℃、100KPa下灭菌 15~20 min。待压力下降为零，温度降低到105℃以下， 打开放气阀排气后，取出三角瓶，平放冷却备用； （7）按上述方法高压灭菌蒸馏水、空三角瓶、培养皿（带滤 纸）及其它相关用具。

29 2、外植体的接种与培养： （1）用长柄镊子取新鲜的长春花叶片愈伤组织细胞，接种 到新鲜培养基表面，每瓶3~4块（每块愈伤组织的大小 约为3mm×3 mm，重约0.5g）； （2）将接种好的三角瓶置于生化培养箱中进行暗培养，培 养温度为26±1℃； （3）每天观察培养情况，记录结果。如：传代培养后，外 植体在形态学上的变化情况，愈伤组织细胞的生长速 率、颜色变化及质地等指标。

30 注意：植物细胞的传代培养常采用新鲜、疏松、生长良好的愈伤组织细胞作为外植体，一般为白色或浅黄色，用镊子比较容易分离。但是，有些植物的愈伤组织细胞生长致密（如长春花愈伤组织细胞），用镊子不易分离。因此，接种时先转入无菌培养皿中，再用手术刀将其切成3mm×3 mm的愈伤组织块，然后接种于新鲜培养基中，每瓶3~4块。 培养过程见图2-2和图2-3。

31 A B C 图2-1 长春花愈伤组织诱导结果 注：以上结果均于MS培养基上暗培 A：叶愈伤组织 B：茎愈伤组织 C：花蕊愈伤组织
图 长春花愈伤组织诱导结果 A：叶愈伤组织 B：茎愈伤组织 C：花蕊愈伤组织 注：以上结果均于MS培养基上暗培 养，诱导时间为24d。 C

32 图2-2 长春花叶片愈伤组织细胞 图2-3 长春花花蕊愈伤组织细胞 MS培养基暗培养28d 接种量：0.83±0.02g
图2-2 长春花叶片愈伤组织细胞 MS培养基暗培养28d 接种量：0.83±0.02g 鲜重增长量：9.04±1.03g 增长倍数：10.84倍 图2-3 长春花花蕊愈伤组织细胞 MS培养基暗培养28d 接种量： 0.45±0.34g 鲜重增长量： 9.07±0.93g 增长倍数： 倍