主讲：刘 红 助教：石美琳 Tel: Mob: 生命科学学院北楼314房间

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1 主讲：刘 红 助教：石美琳 Tel: 88366175 Mob:13791034198 生命科学学院北楼314房间
可自我生长及发光图的绘画 主讲：刘 红 助教：石美琳 Tel: Mob: 生命科学学院北楼314房间

2 实 验 内 容 01 02 03 04 Contents 背景介绍 大肠杆菌绘图 “荧光”图案的显现 荧光图的拍照
实 验 内 容 Contents 背景介绍 01 大肠杆菌绘图 02 03 “荧光”图案的显现 04 荧光图的拍照 模板来自于

3 实验原理——基因的异源表达 质粒（Plasmid）
宿主细胞内独立于染色体DNA之外、能够自主复制的较小DNA分子，是重组DNA技术最常用的载体。 载体（Vector） 运载工具，把目的DNA片段“送入”受体细胞中进行复制和表达的质粒。主要分为克隆载体和表达载体。 究竟如何将这种荧光“移植”到其他生物的呢？

4 实验原理——基因表达 基因表达其实包括两步： 转录（DNA mRNA） 翻译（mRNA 蛋白质） 5’ 启动子 5’UTR CDS
终止区 5’ 3’ 转录起始位点 起始密码子 RBS 终止密码子

5 背景介绍——原核表达载体pET28a Pbr322: the rop gene, coding for the Rop protein, which promotes conversion of the unstable RNA I – RNA II complex to a stable complex and serves to decrease copy number. （控制PMB1 ori copy数在15-20左右，如果删除ROP copy在100以上）。 Ref： Attempts to Construct a Completely Rop- pUC19 by Using NdeI and EcoO1901 Restriction Endonucleases and Blunt-end Ligation。 F1 origin：噬菌体的复制起始位点，有利于产生单链DNA产物从而便于测序和诱变研究。

6 PCR粘性末端克隆法流程 egfp 酶切、连接 PCR扩增目的基因 pET-28a-EGFP 表达载体 重组表达质粒 转化 大肠杆菌表达菌株

7 实 验 材 料 分别携带有绿色、黄色和红色荧光蛋白（GFP、YFP&RFP）基因的大肠杆菌菌液（桌上Ep管中）
实 验 材 料 分别携带有绿色、黄色和红色荧光蛋白（GFP、YFP&RFP）基因的大肠杆菌菌液（桌上Ep管中） 细菌培养基——LB固体培养基平板，一大两小/人 启动（诱导）荧光蛋白基因表达的“钥匙”——IPTG

8 实验操作——涂布诱导剂IPTG 按以上顺序，分别在平板的反面写上自己名字简写+序号，如LH-1、LH-2和LH-3
点燃酒精灯 调好移液器 在2号平板（小）中加入50µl IPTG，涂布均匀 异丙基硫代半乳糖苷, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 在3号平板（大）中加入100µl IPTG，涂布均匀

9 实验操作——创意涂鸦 尽情发挥你的想象和绘画才能吧！ 工具（任选）： 消毒牙签 消毒棉签 接种针 倒置放于37℃培养箱中培养过夜
GFP RFP YFP 工具（任选）： 消毒牙签 消毒棉签 接种针 尽情发挥你的想象和绘画才能吧！ 倒置放于37℃培养箱中培养过夜 大号练手，小号精细

10 实 验 内 容 01 02 03 04 Contents 背景介绍 大肠杆菌绘图 “荧光”图案的显现 荧光图的拍照
实 验 内 容 Contents 背景介绍 01 大肠杆菌绘图 02 03 “荧光”图案的显现 04 荧光图的拍照 模板来自于

11 实验原理——pET系统的蛋白表达调控

12 实验操作——凝胶成像仪检测DNA 荧光拍照 紫外灯下观察 肉眼观察、拍照

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14 大家都见过发出五彩缤纷炫目荧光的海洋生物，如水母啊、珊瑚啊什么的吧？它们是怎么发出荧光的呢？这种荧光是什么？能否“移植”到其他生物从而令其也能发出荧光呢？
本实验就利用“移植”进这些荧光蛋白的大肠杆菌进行绘图，在细菌生长繁殖的同时你的画就“活”了!而当你加入诱导剂这把“钥匙”开启荧光蛋白表达后，你的画就会发出炫目的荧光！这必将会成为你迄今为止最酷最炫的作品！