1.了解引物设计原则 ； 2.掌握primer premier的基本使用方法 。

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1 1.了解引物设计原则 ； 2.掌握primer premier的基本使用方法 。
实验三. PCR引物设计 1.了解引物设计原则 ； 2.掌握primer premier的基本使用方法 。

2 聚合酶链式反应(PCR) 的基本反应步骤 ① ② 变性 95˚C ④ 延伸 72˚C 退火 Tm-2 ˚C ③

3 PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，最初的DNA模板担负起模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5’ 端之间的DNA片段。

4 模 板 DNA P链 待扩增片段 F1链 A链

5 主要产物 5‘ 5’ 第n个循环后各类单链的数量： If P =2 Then F1=2n A =2 - 2(n+1) n+1

6 聚合酶链式反应（PCR）五要素 引物 决定待扩增基因片段的特异性 酶 Taq DNA聚合酶 dNTP 模板 双链DNA
引物 决定待扩增基因片段的特异性 酶 Taq DNA聚合酶 dNTP 模板 双链DNA 缓冲液（内含Mg2+)

7 PCR引物设计基本原则 1. 碱基组成： G+C含量在40%-60%，四种碱基分配均匀；上下游引物G+C含量不能相差太大。
2.退火温度（Tm） 两个引物的Tm值相差最好不要大于2℃；其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 3. 长度： 引物一般为15-30个核苷酸长度。

8 4. 引物自身不能有连续4个或4个以上碱基的互补。
5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’

9 引物的3‘末端不允许结合到除特异性结合位点以外的其他位置上： 引物自身，另一个引物，模板DNA。
5. 引物之间不能有连续4个或4个以上碱基的互补 引物的3‘末端不允许结合到除特异性结合位点以外的其他位置上： 引物自身，另一个引物，模板DNA。 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’

10 6. 非特异性结合： 引物尽量不与模板DNA的其它位置有较多的非特异性结合，即引物序列不要与模板其他位置上的序列有较高的相似性: 不要超过70%或有连续8个互补碱基。

11 7. 3’末端：末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。 最好为C或G，但不要是NCG或NGC，尤其不要是GGG,CCC；
5’ 3’ 5’