第七章 中药制剂中各类化学 成分分析.

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1 第七章 中药制剂中各类化学 成分分析

2 以中药饮片为原料药的中药制剂，治疗疾病的物质基础是其中所含的多种化学成分，包括生物碱类、黄酮类、醌类、皂苷类、萜类、挥发油等成分，这些化学成分由于结构特征不同，其理化性质、提取、分离、纯化方法及鉴别和含量测定方法也存在很大差异。为了全面准确评价中药制剂的质量，建立科学、规范、客观、实用、可行的中药制剂质量标准，应熟悉中药中所含主要类型化学成分的结构特征、理化性质、提取分离、鉴别及含量测定方法。

3 主要内容 生物碱类成分分析 黄酮类成分分析 醌类成分分析 香豆素类成分分析 皂苷类成分分析 萜类及挥发油类成分分析 其他类型成分分析
含动物药、矿物药中药制剂分析

4 第一节 生物碱类成分的分析 一、概述 生物碱 生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋 白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物。因
第一节 生物碱类成分的分析 一、概述 生物碱 生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋 白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物。因 其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。 分布：较广(高等植物中)，种类较多(上万种); 分布具有不均匀性(植物的器官和组织); 生物活性：高，多方面; 活性成分，毒性成分。

5 含生物碱成分的常用中药： 黄连、黄柏、川乌、麻黄、延胡索、苦参、贝母、马钱子等。
绝大多数生物碱具有显著的生物活性，有的为中药制剂的活性成分、有的为毒性成分。如小檗碱有抗菌消炎作用；苦参总生物碱有消肿利尿、抗肿瘤、抗病原体作用；麻黄碱有止咳平喘作用；四氢帕马丁具有镇痛作用；乌头碱、士的宁有毒性作用等。因此中药制剂中含有生物碱时，生物碱成分常作为鉴别、含量测定的依据，如果为毒性成分则作为限量检查的依据，如:乌头中双酯型生物碱的限量检查。

6 二、结构特征和理化性质 （一）结构特征 组成：C、H、N、O 结构类型： 杂环类 大环类 氮原子的存在形式： 萜类 脂氮、芳氮 甾体类
有机胺类 氮原子的存在形式： 脂氮、芳氮 季胺、叔胺、仲胺及伯胺 游离状态和酸结合状态 氮氧配位键 取代基： 烷烃 羟基 羧基、酚羟基 酯键

7 （二）理化性质 1. 物理性状 状态：多数为结晶性固体 少数为无定形粉末 还有一些为液体（槟榔碱等）
个别液体及小分子生物碱具有挥发性或升华性 色泽：一般为无色或白色 少数有色（含有较长共轭体系，并有助色团） 旋光性：与生理活性有关，左旋 > 右旋

8 溶解性 结构特征复杂，溶解性呈现多样化。 游离生物碱: 极性较小 —易溶于CHCl3，Et2O，EtOH等有机溶剂。 生物碱盐: —水溶性增强。 中药制剂中生物碱测定时样品前处理： 应注意结合生物碱成分的不同情况（结构特征、存在状态及溶解性规律）采用相应的提取分离及净化方法。

9 3. 碱性 碱性强弱的影响因素： 氮原子上孤电子对的杂化方式; 氮原子上电子云密度分布; 分子的空间效应; 分子内是否有氢键形成。
主要反应类型：可与酸成盐。 碱性强，在植物中以盐的形式存在； 碱性较弱，在植物中以游离的形式存在； 盐的类型：单酸度盐、二酸度盐等。 碱性强弱是供试液制备、分析方法建立和条件 选择的基础。

10 制备生物碱制剂供试品时要根据生物碱的碱性选择相应的提取溶剂。
碱性很弱的生物碱，在植物体内往往以游离状态存在，可用三氯甲烷等有机溶剂提取。 碱性较强的生物碱多与一些植物酸结合以盐的形式存在，所以用三氯甲烷等有机溶剂提取生物碱时，应先将原料药加碱碱化使生物碱游离后提取。

11 4. 沉淀反应 生物碱 + 试剂 复盐 分子复合物 碘化物的复盐 重金属盐 大分子酸 常用的沉淀剂： 碘-碘化钾，碘化铋钾，碘化汞钾，
酸性水溶液 复盐 分子复合物 生物碱沉淀试剂 碘化物的复盐 重金属盐 大分子酸 常用的沉淀剂： 碘-碘化钾，碘化铋钾，碘化汞钾， 磷钼酸，硅钨酸，磷钨酸，苦味酸, 硫氰酸铬铵，四苯硼钠。 作用：鉴别生物碱； 定量测定生物碱。 干扰(假阳性反应)： 蛋白质、多肽、鞣质。 干扰(假阴性反应) ： 麻黄碱（不与沉淀试剂作用）

12 5. 显色反应 这两类反应，有一定的化学计量关系， 可用于定量测定。 生物碱 + 浓无机酸为主的试剂 不同的颜色 ——只能用于鉴别。
生物碱 + 酸性染料（磺酸肽类） 有色 配合物 氯仿定 量提取 pH 含酯键的 生物碱 异羟肟酸铁 反应试剂 紫红色 这两类反应，有一定的化学计量关系， 可用于定量测定。

13 6. 紫外光谱特征 ——结构中的共轭体系 影响特征吸收峰的因素： 共轭体系中的助色团的种类、位置和数量; 氮原子与发色团的相对位置;
N - 发色团 (参与共轭体系) λmax与pH有关 如：喹啉在酸性溶液中比在中性溶液中显示 红移现象。 具羟基取代苯结构的生物碱 λmax与pH有关。(碱性红移)  检测波长的选择应考虑溶液pH的影响。

14 三、定性鉴别 —— 化学反应法和色谱鉴别法 （一）化学反应法——沉淀反应法(供试液须净化) 马钱子散中生物碱成分的鉴别： 处方：马钱子和地龙
马钱子碱 士的宁 蛋白质、多肽 盐 浓氨水 游离 碘化铋钾 黄棕色 (溶于氯仿) (不溶于氯仿) × 氯仿

15 （二）色谱鉴别法 薄层色谱法（TLC） 纸色谱法（PC） 高效液相色谱法（HPLC）

16 1.薄层色谱法 吸附剂：硅胶或氧化铝 展开剂：低极性溶剂氯仿、苯等 + 其它溶剂 检测：直接日光观察(有色的生物碱)；
UV灯(有荧光的生物碱)； 喷显色剂(改良的碘化铋钾)后观察。 注意：硅胶呈弱酸性，碱性较强的生物碱在板上 容易形成复盐，使Rf值变小或拖尾，形成 复斑。一般在碱性环境下展开。

17 2.纸色谱法 ——鉴别生物碱盐或游离生物碱  生物碱盐 固定相：水。 展开剂：用极性强的酸性溶剂。 常用BAW体系(正丁醇-醋酸-水),
有时可用盐酸替代醋酸。  游离生物碱 固定相：非水性的亲水性溶剂甲酰胺等。 流动相：用甲酰胺饱和的亲脂性有机溶剂 （苯、氯仿或乙酸乙酯等）。  显色剂：同TLC法，但含硫酸的试剂不能用。

18 3.高效液相色谱法 （三）应用实例 鉴别的依据：色谱条件恒定时，tR(i)值恒定。 鉴别方法： 条件恒定: tR(i)为常数；
条件不同: 已知对照品作内标物，采用峰面积或 峰高加大法进行检识。 （三）应用实例 例：急支糖浆中麻黄碱的鉴别—TLC法 薄层板：硅胶G 展开剂：CHCl3-甲醇-浓氨水（40:10:1） 显色试剂： 茚三酮

19 四、含量测定 发展（早期）： 近期： 分光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱法 酸碱滴定法 气相色谱法 沉淀法 高效毛细管电泳法
发展（早期）： 近期： 分光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱法 气相色谱法 高效毛细管电泳法 酸碱滴定法 沉淀法 注意：从提取、净化到测定，每一步都要准确。 准确度：回收率（加样回收率）。

20 （一）总生物碱含量的测定 1.化学法：容量分析法和重量分析法 容量分析法——酸碱滴定法 水溶液 非水溶液 碱性强 剩余量滴定法（回滴）
碱性弱(pKa 2~1)

21 指示终点的方法：指示剂和各种电位法。 指示剂： 水相：溴酚蓝、甲基红、溴甲酚蓝等。 非水：酚酞、甲基黄、溴酚蓝、结晶紫。 供试品的制备：提取、净化、脱水、过滤等。  净化时若用氧化铝，应选择中性氧化铝 并用空白实验校正结果。

22 直接重量法：提取后，使其沉淀，干燥，称重。
用于混合碱、未知结构或分子量相差较大的生物碱 测定。 优点：计算简便，不用换算因数，分子量无影响。 缺点：①挥发性生物碱、遇热不稳定生物碱及碱性 条件下易水解的生物碱不宜。 ②取样量大，易乳化，费时。 重量分析法 生物碱试剂沉淀法 优点：取样量少，灵敏度高。 缺点：计算较复杂；操作繁琐；干扰因素多 （沉淀剂、pH、温度及共存物）。

23 2. 分光光度法 ——单波长光度法 ① 自身的λmax吸收波长作为测定波长。 ② 加显色试剂（亚硝酸钠、雷氏盐、酸性染料等） 显色后测定。 供试液-分离净化方法： 化学法、柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法

24 （1）直接测定 ——利用生物碱自身的光吸收直接进行比色测定 药典收录： 左金丸 戊己丸 驻车丸（P164 例） 桂林西瓜霜 香连丸（片）

25 （2）离子对萃取比色法 生物碱 + 有机溶剂(定量) 酸性染料 磺酸类 酸类阴离子 pH 有色离子对(定量) 比色测定

26  酸性染料： 甲基橙 溴麝香草酚蓝（溴百里酚蓝BTB) 溴甲酚绿  无机离子： Cl-, Br-, I-, ClO4-  磺酸类： 甲苯-4-磺酸 萘-2-磺酸  酸类和羧酸类： 苦味酸 苯甲酸 水杨酸

27 酸性染料比色法（溴百里酚蓝BTB等） B HIn pH In- BH + · In -（有色） pH选择： 依据染料的性质和生物碱的pKa
一般规律： 一元碱和BTB形成1:1的离子对， 5.2＜ pH＜6.4 二元碱和BTB形成1:2的离子对， 3.0＜ pH＜5.8

28 染料： 甲基橙、溴百里酚蓝（BTB)、 溴甲酚绿、
溴酚蓝、溴甲酚紫 有机溶剂选择： 原则——离子对能与有机溶剂形成氢键及成键能力的强弱; 常用——氯仿、二氯甲烷；（不用CCl4，苯等提取率低。) 注意事项：有机溶剂中的微量水会影响测定结果， 水使有机溶剂发生乳化现象。 排除方法：有机溶剂提取液中加入脱水剂（无水 Na2SO4）或经滤纸过滤除去微量水分。

29 雷氏盐比色法 雷氏盐：雷氏铵或硫氰酸铬铵 NH4 [ Cr (NH3)2 (SCN)4 ]·H2O
性质：为暗红色的结晶或结晶性粉末，微溶于冷水，易溶于 热水，可溶于乙醇。 定量依据： 雷氏盐在酸性介质中可与生物碱定量生成难溶于水的有色 配合物(沉淀)。 生物碱与雷氏盐反应的沉淀组成与碱性强弱和pH有关： 生物碱中各氮原子碱性都较强时,在酸性较小的溶液中生成 单盐；在酸性较大的溶液中可相应地生成双盐、叁盐等； 碱性较弱的则无论酸性较高还是较低均生成单盐； 季铵类生物碱分子中有几个季铵氮原子，即与几个沉淀剂 分子结合。

30 测定方法： 生物碱雷氏盐有色沉淀易溶于丙酮，其丙酮溶液所呈现的吸收特征是由于分子结构中硫氰酸铬铵部分，而不是结合的生物碱部分。 1. 将此沉淀过滤洗净后溶于丙酮（或甲醇）直接比色测定，换算成生物碱的含量； 2. 也可以精密加入过量雷氏盐试剂，滤除生成的生物碱雷氏盐沉淀，用滤液在520～526nm （溶于甲醇时，其λmax 为427nm ）进行比色测定残存的过量雷氏盐含量，间接计算生物碱的含量。

31 计算方法： 硫氰酸铬铵在丙酮中的摩尔吸收系数ε=106.5 （单盐），故可根据其吸收值A 按下式直接测定，而不需绘制标准曲线。 m ― 被测物的质量（mg ) M ― 被测物质的分子量 V ― 溶解沉淀所用丙酮的毫升数

32 注意事项： 雷氏盐的水溶液在室温可分解，故用时应新鲜 配制，沉淀也需在低温进行。 供试品如为稀的水溶液（如注射剂等），沉淀
前应浓缩。对于中药制剂含有干扰物质时，应 事先经过纯化处理。 雷氏盐的丙酮或丙酮－水溶液的吸收值，随 时间而有所变化，故应尽快地测定。

33 苦味酸盐比色法(λ=360nm) 生物碱 + 苦味酸 中性或弱酸性 沉淀(定量生成) 氯仿溶后λ=360nm比色 碱性条件下解离释放出游离碱
＋苦味酸 有机溶剂萃取出出游离的生物碱 苦味酸碱液比色

34 异羟肟酸铁比色法 含有酯键结构的生物碱，在碱性介质中加热，酯键水解，产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸，再与Fe3+生成紫红色的配合物，在一定浓度下符合Beer 定律，可用比色法进行含量测定。 干扰： 凡含有酯键（包括内酯）结构的成分均能与试剂反应，因此用此法进行定量时，供试品溶液中必须不存在其他酯类成分，否则对测定结果有影响。

35 应用实例 ——酸性染料比色法 0.1%溴甲酚绿；pH3.0；λ=412nm。 例1 风湿骨痛胶囊中乌头碱总生物碱的含量测定
例1 风湿骨痛胶囊中乌头碱总生物碱的含量测定 ——酸性染料比色法 0.1%溴甲酚绿；pH3.0；λ=412nm。 例2 万氏牛黄清心丸中黄连总季铵碱的测定 ——苦味酸盐比色法(λ=360nm) 例3 产妇康颗粒中益母草总生物碱的含量测定 ——雷氏盐比色法(丙酮介质λ=525nm) 例4 附子注射液中酯型生物碱的含量测定 ——异羟肟酸铁比色法

36 （二）单体生物碱的含量测定 1.TLCS 选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别相似，但要求比鉴别严格。如果使用改良碘化铋钾等作为显色剂时，必须完全挥干展开剂后才可喷洒，否则背景深，反差小，影响测定。  应用举例: 九分散中士的宁的含量测定——薄层扫描法 浓氨水＋氯仿 续滤液 氯仿供试品液 GF254薄层板 双波长扫描 冷浸24h 稀H2SO4液 氨水碱化 氯仿提取 提取

37 2.HPLC 液-液分配色谱法 正相 液-固吸附色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法 反相 注意事项：
用硅烷化试剂对硅胶进行化学修饰，硅胶表面仍存有游离的硅醇基，不同厂家生产的色谱柱中其游离硅醇基的含量也不同，即使同一厂家，不同批号的固定相填料，其游离硅醇基也不尽相同。由于硅醇基酸性较大，生物碱类成分可与其牢固地键合，从而影响色谱行为，使保留时间延长，峰形变宽，拖尾。为了克服游离硅醇基的影响，可采取以下措施：

38 (1) 改进流动相 ① 在流动相中加入硅醇基抑制剂，竞争或部分阻断硅醇 基的影响，最常用的硅醇基抑制剂是二乙胺、三乙胺 （TEA）等。
① 在流动相中加入硅醇基抑制剂，竞争或部分阻断硅醇 基的影响，最常用的硅醇基抑制剂是二乙胺、三乙胺 （TEA）等。 ② 在合适的pH 下，流动相中加入低浓度离子对试剂，可 通过与生物碱类成分生成离子对而掩其碱性基团，使 之不会与固定相表面的硅醇基作用，离子对试剂常 用 辛烷磺酸钠或十二烷基磺酸钠表面活性剂，系统偏 酸 性。采用离子对色谱系统后必须马上清洗柱子，避 免 过夜，以保证色谱柱的寿命。 ③ 也可以在流动相中加入季铵盐试剂掩蔽固定相表面的硅 醇基，例如在水－甲醇流动相中加入0.01 mol/L的溴化 四甲基胺，能在较短的保留时间内得到很好的分离，色 谱峰重现性好，也不拖尾，而且水与甲醇比例的改变以 及pH 的变化都不影响峰的对称性。 ④ 在流动相中加入一定量的电解质缓冲盐，改变流动相的离 子强度，稳定pH及促进离子对相互作用，而起到改善峰形 及分离效果的作用。

39 ——封尾技术，减少残余羟基，增加单体覆盖度。
(2) 改进固定相 ——封尾技术，减少残余羟基，增加单体覆盖度。 封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进行进一步的反应。由于C18烷基硅烷相对较大的体积，使得C18 和其它键合相在发生键合反应时只能覆盖不到硅胶表面的 50% 。 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。

40 反相HPLC的流动相： 中性的——不加酸碱。 酸性的——磷酸、磷酸盐缓冲液。 碱性的——三乙胺、氨水。 酸碱系统——既有酸又有碱。 液-固吸附色谱： 固定相——原型硅胶 分离机理——生物碱的碱性，与亲脂性无关； 流动相——常用甲醇-醋酸盐缓冲液； 优点——可排除酸性和中性杂质的干扰；且流动 相组成比较简单。

41 离子交换色谱法： 固定相——阳离子交换树脂 分离机理——利用质子化的生物碱阳离子与离子 交换剂交换能力之间的差异而分离。 HPLC的检测器： UV、电化学、化学发光、荧光、质谱 例1: 烧伤止痛膏中小檗碱的含量测定(RP－HPLC法) ※ 十二烷基磺酸钠的作用：离子对试剂，减少硅羟基 的影响。 例2：小儿清热止咳口服液中盐酸麻黄碱的含量测定 (RP－HPLC法)

42 适用范围：有挥发性的，遇热不分解的生物碱类。如：麻黄碱、槟榔碱、苦参碱和颠茄类生物碱等。
3.气相色谱法 适用范围：有挥发性的，遇热不分解的生物碱类。如：麻黄碱、槟榔碱、苦参碱和颠茄类生物碱等。 供试液的制备应采用冷提取，净化过程也要避免加热，一防成分流失，最后用氯仿等低极性溶剂为溶媒制备成供试液。 4.毛细管电泳法

43 五、常见生物碱成分分析 化合物名称 结构式 理化性质、结构及 光谱特征 常用定量分析 方法 小檗碱 （黄连素） Berberine
(Umbellatine) （C20H18NO4；336.37） 异喹啉类原小檗碱型 生物碱、季铵型生物碱、有共轭体系。 黄色结晶、碱性较 强，易溶于热水或 热乙醇，微溶或不 溶于苯、氯仿、丙 酮，其盐酸盐水中 溶解度小。 mp：1450 ℃ UV：225 ，270 ，331。 重量法、滴定法 分光光度法 薄层扫描法 薄层荧光扫描法 高效液相色谱法 脉冲极谱法 流动色谱分析法 酶法

44 化合物名称 结构式 理化性质、结构及光谱特征 常用定量分析方法 士的宁 （番木鳖碱） Strychnine （C21H20N2 O2;334.40） 单萜吲哚类生物 碱、环叔胺显碱 性、酰胺不显碱 性。 难溶于水，可溶于乙醇，甲醇。易溶于氯仿，微溶于乙醚。 mp：268～290℃。 UV：282。 重量法 滴定法 分光光度法 一阶导数分光光度法 薄层扫描法 高效液相色谱法

45 化合物 名称 结构式 理化性质、结构及光谱特征 常用定量分析方法 乌头碱 Aconitine （C34H47 N O11; ） 二萜类酯型生物 碱。 易溶于氯仿、苯、 无水乙醇和醚， 难溶于水、微溶石油醚 mp：204℃ UV:281,273,230, 202． 滴定法 酸性染料比色法 一阶导数紫外分光光度法 薄层扫描法 高效液相色谱法